中国生化药物杂志
中國生化藥物雜誌
중국생화약물잡지
CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMICAL PHARMACEUTICS
2014年
5期
164-166
,共3页
包剑铭%郭小帆%赵雪飞%李雨丽%梁艺旋%唐金宝
包劍銘%郭小帆%趙雪飛%李雨麗%樑藝鏇%唐金寶
포검명%곽소범%조설비%리우려%량예선%당금보
大肠杆菌%碱性磷酸酶%细胞质%可溶性表达
大腸桿菌%堿性燐痠酶%細胞質%可溶性錶達
대장간균%감성린산매%세포질%가용성표체
Escherichia coli%alkaline phosphatase%prokaryotic cytoplasm%soluble expression
目的 构建原核表达载体pEAP,在E.coil BL21(DE3)中实现大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞内可溶性表达,为进一步研究工程菌的大体积培养条件、提高其表达量提供理论基础.方法 以质粒pDAP2为模板扩增不含信号肽的EAP基因,克隆至pGreen-S质粒构建表达载体pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株表达EAP,采用SDS-PAGE及EAP酶活性测定对表达产物的可溶性及胞内定位进行分析;Ni2+亲和层析方式纯化目的蛋白并测定其比活力.结果 经PCR、双酶切及测序分析证实载体构建正确,所表达目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌体细胞质,其相对分子量与理论值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白经His Trap亲和层析纯化后,其电泳纯度在90％以上,酶比活力可达358.6 U/mg.结论 成功构建pEAP质粒表达载体,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞内主要以可溶性形式表达,为进一步更经济、高效制备EAP奠定了一定的实验基础.
目的 構建原覈錶達載體pEAP,在E.coil BL21(DE3)中實現大腸桿菌堿性燐痠酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞內可溶性錶達,為進一步研究工程菌的大體積培養條件、提高其錶達量提供理論基礎.方法 以質粒pDAP2為模闆擴增不含信號肽的EAP基因,剋隆至pGreen-S質粒構建錶達載體pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株錶達EAP,採用SDS-PAGE及EAP酶活性測定對錶達產物的可溶性及胞內定位進行分析;Ni2+親和層析方式純化目的蛋白併測定其比活力.結果 經PCR、雙酶切及測序分析證實載體構建正確,所錶達目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌體細胞質,其相對分子量與理論值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白經His Trap親和層析純化後,其電泳純度在90％以上,酶比活力可達358.6 U/mg.結論 成功構建pEAP質粒錶達載體,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞內主要以可溶性形式錶達,為進一步更經濟、高效製備EAP奠定瞭一定的實驗基礎.
목적 구건원핵표체재체pEAP,재E.coil BL21(DE3)중실현대장간균감성린산매(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)적포내가용성표체,위진일보연구공정균적대체적배양조건、제고기표체량제공이론기출.방법 이질립pDAP2위모판확증불함신호태적EAP기인,극륭지pGreen-S질립구건표체재체pEAP,이E.coli BL21(ED3)균주표체EAP,채용SDS-PAGE급EAP매활성측정대표체산물적가용성급포내정위진행분석;Ni2+친화층석방식순화목적단백병측정기비활력.결과 경PCR、쌍매절급측서분석증실재체구건정학,소표체목적단백주요이가용성형식존재우BL21(ED3)균체세포질,기상대분자량여이론치상부(47kD)차구유EAP최화활성;목적단백경His Trap친화층석순화후,기전영순도재90％이상,매비활력가체358.6 U/mg.결론 성공구건pEAP질립표체재체,목적단백재BL21(ED3)균주포내주요이가용성형식표체,위진일보경경제、고효제비EAP전정료일정적실험기출.
