贵阳医学院学报
貴暘醫學院學報
귀양의학원학보
JOURNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE
2014年
4期
475-478
,共4页
刘亚伟%李翠%何敏毅%赵亮%漆松涛%陈剑荣
劉亞偉%李翠%何敏毅%趙亮%漆鬆濤%陳劍榮
류아위%리취%하민의%조량%칠송도%진검영
LIM激酶1%载体构建%基因表达%融合蛋白%细胞内定位%突变体
LIM激酶1%載體構建%基因錶達%融閤蛋白%細胞內定位%突變體
LIM격매1%재체구건%기인표체%융합단백%세포내정위%돌변체
Limk1%vector construction%gene expression%fusion protein%intracellular localization%mutants
目的:构建LIM激酶(Limk)1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位.方法:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号(NLS)缺失突变,命名为Limk1-NLS(del);用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位.结果:经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS (del)主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核.结论:成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位.
目的:構建LIM激酶(Limk)1不同突變體的HA融閤錶達載體,併在真覈細胞中錶達,觀察這些突變體在細胞內定位.方法:利用聚閤酶鏈式反應(PCR)擴增Limk1全長序列,構建HA-Limk1真覈錶達質粒;利用定點突變策略對HA-Limk1進行覈定位信號(NLS)缺失突變,命名為Limk1-NLS(del);用閤成兩條互補序列退火穫得目標片段插入載體的策略構建Limk1-NLS;將2錶達質粒轉染HepG2細胞,細胞免疫熒光方法以及覈質分離後用western-blot檢測其在細胞中定位.結果:經測序鑒定Limk1及其不同突變體序列正確,在HepG2細胞中高錶達;其中HA-Limk1在細胞質、細胞覈均有錶達,Limk1-NLS (del)主要定位于細胞質,Limk1-NLS主要定位于細胞覈.結論:成功構建瞭Limk1全長及不同突變體的HA融閤錶達載體,初步明確突變體在細胞內的定位.
목적:구건LIM격매(Limk)1불동돌변체적HA융합표체재체,병재진핵세포중표체,관찰저사돌변체재세포내정위.방법:이용취합매련식반응(PCR)확증Limk1전장서렬,구건HA-Limk1진핵표체질립;이용정점돌변책략대HA-Limk1진행핵정위신호(NLS)결실돌변,명명위Limk1-NLS(del);용합성량조호보서렬퇴화획득목표편단삽입재체적책략구건Limk1-NLS;장2표체질립전염HepG2세포,세포면역형광방법이급핵질분리후용western-blot검측기재세포중정위.결과:경측서감정Limk1급기불동돌변체서렬정학,재HepG2세포중고표체;기중HA-Limk1재세포질、세포핵균유표체,Limk1-NLS (del)주요정위우세포질,Limk1-NLS주요정위우세포핵.결론:성공구건료Limk1전장급불동돌변체적HA융합표체재체,초보명학돌변체재세포내적정위.
