现代检验医学杂志
現代檢驗醫學雜誌
현대검험의학잡지
JOURNAL OF MODERN LABORATORY MEDICINE
2014年
4期
1-4,172
,共5页
王亚文%惠凌云%张琳%冯艾%王威%马列婷%王全颖%杨广笑%刘正稳
王亞文%惠凌雲%張琳%馮艾%王威%馬列婷%王全穎%楊廣笑%劉正穩
왕아문%혜릉운%장림%풍애%왕위%마렬정%왕전영%양엄소%류정은
鸭乙肝病毒%cccDNA%实时荧光定量PCR
鴨乙肝病毒%cccDNA%實時熒光定量PCR
압을간병독%cccDNA%실시형광정량PCR
duck hepatitis B virus (DHBV)%covalently closed circular DNA (cccDNA)%real-time fluorescent quantitative PCR
目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X+48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.
目的 建立基于DHBV病毒正、負鏈缺口區設計引物、沉澱蛋白結閤的DNA、酶切消化殘留線性DNA的DHBVcccDNA熒光定量PCR方法.方法 根據DHBV cccDNA和rcDNA結構的不同,將引物設計在DHBV DNA負鏈缺口的兩側.採用十二烷基硫痠鉀蛋白質沉澱法分離肝組織中cccDNA和rcDNA.併對提取的DNA進行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,計算PSAD的用量,酶切消化殘存的線性DNA.以pBR322/2DHBV Core重組質粒為PCR標準品,通過優化反應體繫和擴增條件,建立檢測DHBV cccDNA的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法,併進行方法學攷察和實際應用.結果 優化的PCR擴增產物電泳後可見239 bp的DNA片段,與目標片段長度相同.標準麯線迴歸方程Y=-4.085 7X+48.805,R2=-0.997 6.方法的靈敏度為103 copies/ml,線性範圍可達103～108 copies/ml.方法特異性彊,未檢齣DHV,HBV及E coli DNA.對已感染DHBV的鴨肝組織檢測DHBV cccDNA,進行定量,含量從0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分佈最廣的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA佔總DHBV DNA的比例平均僅為3.86％,範圍從0.01％～13.3s％.結論 根據DHBV cccDNA與rcDNA的結構和理化性質的差異,設計能夠特異性擴增DHBV cccDNA的熒光定量PCR方法,方法靈敏度高、特異度彊,可廣汎應用于DHBV和HBV抗病毒治療策略的相關研究中.
목적 건립기우DHBV병독정、부련결구구설계인물、침정단백결합적DNA、매절소화잔류선성DNA적DHBVcccDNA형광정량PCR방법.방법 근거DHBV cccDNA화rcDNA결구적불동,장인물설계재DHBV DNA부련결구적량측.채용십이완기류산갑단백질침정법분리간조직중cccDNA화rcDNA.병대제취적DNA진행자외정량,안조매2UPSAD소화500ng cccDNA,계산PSAD적용량,매절소화잔존적선성DNA.이pBR322/2DHBV Core중조질립위PCR표준품,통과우화반응체계화확증조건,건립검측DHBV cccDNA적SYBR Green I실시형광정량PCR방법,병진행방법학고찰화실제응용.결과 우화적PCR확증산물전영후가견239 bp적DNA편단,여목표편단장도상동.표준곡선회귀방정Y=-4.085 7X+48.805,R2=-0.997 6.방법적령민도위103 copies/ml,선성범위가체103～108 copies/ml.방법특이성강,미검출DHV,HBV급E coli DNA.대이감염DHBV적압간조직검측DHBV cccDNA,진행정량,함량종0.36～1733.08 copies/diploid genome.기중분포최엄적시10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA점총DHBV DNA적비례평균부위3.86％,범위종0.01％～13.3s％.결론 근거DHBV cccDNA여rcDNA적결구화이화성질적차이,설계능구특이성확증DHBV cccDNA적형광정량PCR방법,방법령민도고、특이도강,가엄범응용우DHBV화HBV항병독치료책략적상관연구중.
