工业微生物
工業微生物
공업미생물
INDUSTRIAL MICROBIOLOGY
2014年
4期
52-58
,共7页
孙晨%肖慈英%郭美锦%储炬%张嗣良
孫晨%肖慈英%郭美錦%儲炬%張嗣良
손신%초자영%곽미금%저거%장사량
易错PCR%定向进化%高通量筛选%红酵母D-氨基酸氧化酶
易錯PCR%定嚮進化%高通量篩選%紅酵母D-氨基痠氧化酶
역착PCR%정향진화%고통량사선%홍효모D-안기산양화매
error-prone PCR%directed evolution%high-throughput screening%RgDAAO
采用易错PCR技术对来源于红酵母Rhodotorula gracilis的D-氨基酸氧化酶基因(RgDAAO)进行突变,构建并优化了突变株文库;结合48深孔板的高通量筛选方法,获得突变株M3217,其Vmax相对于野生型提高了16.8％.对测序结果进行分析,发现突变酶基因序列中有5处点突变,其中3处发生了氨基酸置换,分别为:D242V/Q253R/D304V.利用Swiss-Model对突变株M3217进行三维结构模拟,结果显示所有突变位点都不在催化活性中心的附近,特别是V304的位置在连接F5和F6两个β折叠股的长loop环上.推测D304V这一突变位点很可能增强了RgDAAO二聚体形态的稳定性,或是增强了与辅酶FAD的结合能力,从而间接提高了全酶的催化活力.
採用易錯PCR技術對來源于紅酵母Rhodotorula gracilis的D-氨基痠氧化酶基因(RgDAAO)進行突變,構建併優化瞭突變株文庫;結閤48深孔闆的高通量篩選方法,穫得突變株M3217,其Vmax相對于野生型提高瞭16.8％.對測序結果進行分析,髮現突變酶基因序列中有5處點突變,其中3處髮生瞭氨基痠置換,分彆為:D242V/Q253R/D304V.利用Swiss-Model對突變株M3217進行三維結構模擬,結果顯示所有突變位點都不在催化活性中心的附近,特彆是V304的位置在連接F5和F6兩箇β摺疊股的長loop環上.推測D304V這一突變位點很可能增彊瞭RgDAAO二聚體形態的穩定性,或是增彊瞭與輔酶FAD的結閤能力,從而間接提高瞭全酶的催化活力.
채용역착PCR기술대래원우홍효모Rhodotorula gracilis적D-안기산양화매기인(RgDAAO)진행돌변,구건병우화료돌변주문고;결합48심공판적고통량사선방법,획득돌변주M3217,기Vmax상대우야생형제고료16.8％.대측서결과진행분석,발현돌변매기인서렬중유5처점돌변,기중3처발생료안기산치환,분별위:D242V/Q253R/D304V.이용Swiss-Model대돌변주M3217진행삼유결구모의,결과현시소유돌변위점도불재최화활성중심적부근,특별시V304적위치재련접F5화F6량개β절첩고적장loop배상.추측D304V저일돌변위점흔가능증강료RgDAAO이취체형태적은정성,혹시증강료여보매FAD적결합능력,종이간접제고료전매적최화활력.
