岭南现代临床外科
嶺南現代臨床外科
령남현대림상외과
LINGNAN MODERN CLINICS IN SURGERY
2014年
5期
499-504
,共6页
邓洁敏%邓小耿%蒋雯丽%邱荣林%伍耀豪%曾乐祥%周嘉嘉%张杰
鄧潔敏%鄧小耿%蔣雯麗%邱榮林%伍耀豪%曾樂祥%週嘉嘉%張傑
산길민%산소경%장문려%구영림%오요호%증악상%주가가%장걸
HNF%HNF4A%慢病毒%载体构建
HNF%HNF4A%慢病毒%載體構建
HNF%HNF4A%만병독%재체구건
目的 构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础.方法 利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度.将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达.结果 重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1 a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液.病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强.结论 通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体.
目的 構建肝細胞覈因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A)的過錶達慢病毒載體,併對其進行病毒包裝、鑒定與滴度測定,為進一步研究HNF4A的功能和作用機製奠定基礎.方法 利用PCR法擴增人類基因組DNA中HNF4A的cDNA序列,併將其剋隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒錶達載體上,經雙酶切及測序鑒定,將暘性重組PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro錶達載體、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三質粒共轉染到HEK-293T細胞,收集上清,將穫得的病毒懸液濃縮後梯度稀釋後感染HEK-293T細胞,併利用綠色熒光蛋白檢測病毒滴度.將重組慢病毒感染原代培養人皮膚成纖維細胞HFFs,併利用熒光定量PCR檢測HNF-4A的錶達.結果 重組慢病毒錶達載體PCDH-CMV-HNF4A-EF1 a-GFP-puro酶切及測序鑒定證明載體構建成功,併得到滴度為1×108 TU/mL的病毒液.病毒感染人皮膚成纖維細胞後HNF4A錶達顯著增彊.結論 通過優化載體構建方法成功構建人HNF4A的重組慢病毒載體併可在HFFs內顯著過錶達HNF4A,為HNF4A的研究提供更高效穩定的基因載體.
목적 구건간세포핵인자4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A)적과표체만병독재체,병대기진행병독포장、감정여적도측정,위진일보연구HNF4A적공능화작용궤제전정기출.방법 이용PCR법확증인류기인조DNA중HNF4A적cDNA서렬,병장기극륭지PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro만병독표체재체상,경쌍매절급측서감정,장양성중조PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro표체재체、pCMV-VSV-G화pCMV-dR8.91삼질립공전염도HEK-293T세포,수집상청,장획득적병독현액농축후제도희석후감염HEK-293T세포,병이용록색형광단백검측병독적도.장중조만병독감염원대배양인피부성섬유세포HFFs,병이용형광정량PCR검측HNF-4A적표체.결과 중조만병독표체재체PCDH-CMV-HNF4A-EF1 a-GFP-puro매절급측서감정증명재체구건성공,병득도적도위1×108 TU/mL적병독액.병독감염인피부성섬유세포후HNF4A표체현저증강.결론 통과우화재체구건방법성공구건인HNF4A적중조만병독재체병가재HFFs내현저과표체HNF4A,위HNF4A적연구제공경고효은정적기인재체.
