河南农业科学
河南農業科學
하남농업과학
JOURNAL OF HENAN AGRICULTURAL SCIENCES
2014年
10期
112-116
,共5页
李博文%孙国鹏%王爱国%岳锋%张艳芳%朱艳平%银梅%杨媛%郭东光%王选年
李博文%孫國鵬%王愛國%嶽鋒%張豔芳%硃豔平%銀梅%楊媛%郭東光%王選年
리박문%손국붕%왕애국%악봉%장염방%주염평%은매%양원%곽동광%왕선년
鸡%程序性细胞死亡因子 1%胞外区%克隆%原核表达%生物学活性
鷄%程序性細胞死亡因子 1%胞外區%剋隆%原覈錶達%生物學活性
계%정서성세포사망인자 1%포외구%극륭%원핵표체%생물학활성
chicken%PD-1%extracelluar region%clone%prokaryotic expression%biological activity
为研究鸡程序性细胞死亡因子1（PD 1）胞外区的生物学活性，根据 GenBank 中的鸡 PD 1基因序列，经生物信息学比对分析，设计鸡 PD 1胞外区特异性克隆引物，扩增目的基因，连接原核表达载体 pET 28a（＋），构建重组表达载体 pET 28a PD 1，转化至 Rosetta（DE3）大肠杆菌，并对IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间进行优化，对表达产物进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析，应用流式细胞术对所获得重组蛋白的生物学活性进行鉴定。结果显示，成功克隆了鸡 PD 1胞外区基因；SDS PAGE 和 Western blot 分析结果表明，37℃、0．1 mmol/L IPTG 诱导4 h 时，PD 1胞外区融合蛋白表达量最高，以包涵体形式存在；流式细胞术分析结果表明，PD 1胞外区重组蛋白具有一定的生物学活性。
為研究鷄程序性細胞死亡因子1（PD 1）胞外區的生物學活性，根據 GenBank 中的鷄 PD 1基因序列，經生物信息學比對分析，設計鷄 PD 1胞外區特異性剋隆引物，擴增目的基因，連接原覈錶達載體 pET 28a（＋），構建重組錶達載體 pET 28a PD 1，轉化至 Rosetta（DE3）大腸桿菌，併對IPTG 濃度、誘導溫度、誘導時間進行優化，對錶達產物進行 SDS PAGE 和 Western blot 分析，應用流式細胞術對所穫得重組蛋白的生物學活性進行鑒定。結果顯示，成功剋隆瞭鷄 PD 1胞外區基因；SDS PAGE 和 Western blot 分析結果錶明，37℃、0．1 mmol/L IPTG 誘導4 h 時，PD 1胞外區融閤蛋白錶達量最高，以包涵體形式存在；流式細胞術分析結果錶明，PD 1胞外區重組蛋白具有一定的生物學活性。
위연구계정서성세포사망인자1（PD 1）포외구적생물학활성，근거 GenBank 중적계 PD 1기인서렬，경생물신식학비대분석，설계계 PD 1포외구특이성극륭인물，확증목적기인，련접원핵표체재체 pET 28a（＋），구건중조표체재체 pET 28a PD 1，전화지 Rosetta（DE3）대장간균，병대IPTG 농도、유도온도、유도시간진행우화，대표체산물진행 SDS PAGE 화 Western blot 분석，응용류식세포술대소획득중조단백적생물학활성진행감정。결과현시，성공극륭료계 PD 1포외구기인；SDS PAGE 화 Western blot 분석결과표명，37℃、0．1 mmol/L IPTG 유도4 h 시，PD 1포외구융합단백표체량최고，이포함체형식존재；류식세포술분석결과표명，PD 1포외구중조단백구유일정적생물학활성。
In order to study the biological activity of chicken PD-1 extracelluar region,the extracellular region primers were designed and the chicken PD-1 extracelluar region gene was cloned according to PD-1 gene in GenBank by bioinformatics comparation.The purified fragment was ligated into pET-28a vector,ligated DNA was transformed in the E.coli strain Rosetta(DE3) after identification by sequencing.The identification of expression product by SDS-PAGE,western blot and flow cytometry after optimizing the various expression conditions such as concentration of IPTG and its action time and temperature.The result showed that the chicken PD-1 extracelluar region gene was successfully cloned.PD-1 presented as a form of inclusion bodies and its experssion was highest when it was induced by addition of IPTG to a final concentration of 0·1 mmol/L for 4 h at 37 ℃.Meanwhile the result of flow cytometry showed that the recombinant protein of PD-1 extracelluar region retained some biologic activity.
