现代肿瘤医学
現代腫瘤醫學
현대종류의학
JOURNAL OF MODERN ONCOLOGY
2014年
11期
2538-2542
,共5页
王玉凤%幺坤%关泉林%祝秉东
王玉鳳%幺坤%關泉林%祝秉東
왕옥봉%요곤%관천림%축병동
烯醇化酶-α%原核表达%纯化%多克隆抗体
烯醇化酶-α%原覈錶達%純化%多剋隆抗體
희순화매-α%원핵표체%순화%다극륭항체
Enolase-α%pronueleus expression%purification%polyclonal antibodies
目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体.方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶切,回收酶切产物并用T4连接酶连接,获得重组质粒pET30a(+)-ENO1.将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,利用纯化的ENO1活性蛋白作为抗原免疫家兔,制备抗血清多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性.结果:目的基因与原核表达载体经双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果表明重组人ENO1基因序列与NCBI(NM_001428.3)公布序列一致.经SDS-PAGE分析,结果显示重组蛋白的分子量约在47kDa,条带单一,无杂带出现,主要以可溶性形式存在.Western blot证实多克隆抗体制备成功.结论:成功表达、纯化了ENO1融合蛋白,制备了具有高特异性的多克隆抗体,为进一步肿瘤疫苗的研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础.
目的:構建人ENO1(human Enolase-α)基因的原覈錶達質粒,誘導重組蛋白的錶達,利用純化後的蛋白製備具有活性的ENO1多剋隆抗體.方法:用PCR方法從胃癌MKN45細胞全基因組中擴增齣目的基因ENO1,將目的基因和原覈錶達載體pET30a(+)分彆雙酶切,迴收酶切產物併用T4連接酶連接,穫得重組質粒pET30a(+)-ENO1.將重組質粒轉入大腸埃希菌菌株BL21,經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導錶達,用Ni-NTA親和層析柱純化,利用純化的ENO1活性蛋白作為抗原免疫傢兔,製備抗血清多剋隆抗體,併用Western blot檢測其特異性.結果:目的基因與原覈錶達載體經雙酶切鑒定所切下的片段大小與理論值相符,測序結果錶明重組人ENO1基因序列與NCBI(NM_001428.3)公佈序列一緻.經SDS-PAGE分析,結果顯示重組蛋白的分子量約在47kDa,條帶單一,無雜帶齣現,主要以可溶性形式存在.Western blot證實多剋隆抗體製備成功.結論:成功錶達、純化瞭ENO1融閤蛋白,製備瞭具有高特異性的多剋隆抗體,為進一步腫瘤疫苗的研製和腫瘤標誌物快速診斷的研究奠定基礎.
목적:구건인ENO1(human Enolase-α)기인적원핵표체질립,유도중조단백적표체,이용순화후적단백제비구유활성적ENO1다극륭항체.방법:용PCR방법종위암MKN45세포전기인조중확증출목적기인ENO1,장목적기인화원핵표체재체pET30a(+)분별쌍매절,회수매절산물병용T4련접매련접,획득중조질립pET30a(+)-ENO1.장중조질립전입대장애희균균주BL21,경이병기-β-D-류대반유당감(IPTG)유도표체,용Ni-NTA친화층석주순화,이용순화적ENO1활성단백작위항원면역가토,제비항혈청다극륭항체,병용Western blot검측기특이성.결과:목적기인여원핵표체재체경쌍매절감정소절하적편단대소여이론치상부,측서결과표명중조인ENO1기인서렬여NCBI(NM_001428.3)공포서렬일치.경SDS-PAGE분석,결과현시중조단백적분자량약재47kDa,조대단일,무잡대출현,주요이가용성형식존재.Western blot증실다극륭항체제비성공.결론:성공표체、순화료ENO1융합단백,제비료구유고특이성적다극륭항체,위진일보종류역묘적연제화종류표지물쾌속진단적연구전정기출.
