南京林业大学学报（自然科学版）
南京林業大學學報（自然科學版）
남경임업대학학보（자연과학판）
JOURNAL OF NANJING FORESTRY UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)
2014年
6期
105-109
,共5页
痤疮丙酸杆菌%亚油酸异构酶%共轭亚油酸%酶学性质
痤瘡丙痠桿菌%亞油痠異構酶%共軛亞油痠%酶學性質
좌창병산간균%아유산이구매%공액아유산%매학성질
Propionibacterium acnes%conjugated linoleic acid isomerase%conjugated linoleic acid%enzymatic properties
为了研究使用生物酶法制备共轭亚油酸的可行性，笔者对痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶进行了异源表达和理化性质研究。根据大肠杆菌偏好密码子，优化了来源于痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶（ PAI）的基因（ pai），将克隆的基因在BL21（ DE3）中进行表达，纯化目的蛋白，获得重组PAI蛋白。 SDS－PAGE结果显示，重组PAI分子质量为48 ku，重组蛋白主要以包涵体沉淀的形式存在。经测定重组PAI在35℃、pH 7．0时酶活最高，比酶活为752．3μmol/（ min·mg）。经35℃保温2 h，酶活保持90％以上，pH为6．5～7．0时，PAI具有较好的稳定性，Mn2＋和Zn2＋对酶活力分别有22．4％和15．8％的抑制作用，以亚油酸为底物时该酶的Km 值为1．13 mmol/L， kcat为4．67 s－1。相关分析表明，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶性质优良，适合以亚油酸为底物生物催化制备共轭亚油酸。
為瞭研究使用生物酶法製備共軛亞油痠的可行性，筆者對痤瘡丙痠桿菌亞油痠異構酶進行瞭異源錶達和理化性質研究。根據大腸桿菌偏好密碼子，優化瞭來源于痤瘡丙痠桿菌亞油痠異構酶（ PAI）的基因（ pai），將剋隆的基因在BL21（ DE3）中進行錶達，純化目的蛋白，穫得重組PAI蛋白。 SDS－PAGE結果顯示，重組PAI分子質量為48 ku，重組蛋白主要以包涵體沉澱的形式存在。經測定重組PAI在35℃、pH 7．0時酶活最高，比酶活為752．3μmol/（ min·mg）。經35℃保溫2 h，酶活保持90％以上，pH為6．5～7．0時，PAI具有較好的穩定性，Mn2＋和Zn2＋對酶活力分彆有22．4％和15．8％的抑製作用，以亞油痠為底物時該酶的Km 值為1．13 mmol/L， kcat為4．67 s－1。相關分析錶明，痤瘡丙痠桿菌亞油痠異構酶性質優良，適閤以亞油痠為底物生物催化製備共軛亞油痠。
위료연구사용생물매법제비공액아유산적가행성，필자대좌창병산간균아유산이구매진행료이원표체화이화성질연구。근거대장간균편호밀마자，우화료래원우좌창병산간균아유산이구매（ PAI）적기인（ pai），장극륭적기인재BL21（ DE3）중진행표체，순화목적단백，획득중조PAI단백。 SDS－PAGE결과현시，중조PAI분자질량위48 ku，중조단백주요이포함체침정적형식존재。경측정중조PAI재35℃、pH 7．0시매활최고，비매활위752．3μmol/（ min·mg）。경35℃보온2 h，매활보지90％이상，pH위6．5～7．0시，PAI구유교호적은정성，Mn2＋화Zn2＋대매활력분별유22．4％화15．8％적억제작용，이아유산위저물시해매적Km 치위1．13 mmol/L， kcat위4．67 s－1。상관분석표명，좌창병산간균아유산이구매성질우량，괄합이아유산위저물생물최화제비공액아유산。
In order to study on the feasibility for the enzymatic synthesis of conjugated linoleic acid ( CLA) , the linoleic acid ( LA) isomerase from Propionibacterium acnes was cloned and overexpressed in Escherichia coli, and characterized. The LA isomerase gene ( pai) from P. acnes was improved by using codon optimization as E. coli codon usage. The DNA sequence encoding modified LA isomerase was cloned into pET-20b, yielding pET-20b-pai, and transformed into E. coli BL21( DE3) . The recombinant LA isomerase had a molecular mass of 48 ku showing mainly in inclusion body on SDS-PAGE. The gene product was purified by Ni-NTA and the activity was 752.3μmol/( min·mg) after induction and purification. At pH 7?0 and 35 ℃, the activity of enzyme reached the maximum. The purified enzyme was stable from pH 6.5 to pH7?5, and retained approx. 90% of its activity after 2 h at 35 ℃. A low?level inhibition of LA isomerase (22.4%) and (15?8%) was observed with Mn2+ and Zn2+(1 mmol/L), respectively. The recombinant LA isomerase had a Km of 1.13 mmol/L and kcat of 4.67 s-1 for linoleic acid. The result showed that the P. acnes linoleate isomerase can effectively catalyze LA to trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid ( t10, c12 CLA) .
