中华肝脏病杂志
中華肝髒病雜誌
중화간장병잡지
CHINESE JOURNAL OF HEPATOLOGY
2013年
12期
949-954
,共6页
刘慧敏%阎立惠%罗争%孙晓萌%崔瑞冰%李学会%阎明
劉慧敏%閻立惠%囉爭%孫曉萌%崔瑞冰%李學會%閻明
류혜민%염립혜%라쟁%손효맹%최서빙%리학회%염명
肝疾病,酒精性%HepG2细胞%钙池操纵的钙离子通道
肝疾病,酒精性%HepG2細胞%鈣池操縱的鈣離子通道
간질병,주정성%HepG2세포%개지조종적개리자통도
Liver disease,alcoholic%HepG2 cells%Store operated Ca2+ channels
目的 研究乙醇诱导肝细胞钙超载的机制及钙池操纵的钙离子通道(SOCs)在其中的作用. 方法 使用浓度梯度的乙醇处理HepG2细胞,并观察细胞外钙离子螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)及SOCs抑制剂2-APB对200μmol/L乙醇刺激的干预效应.实验分为:(1)正常对照组:磷酸盐缓冲液刺激;(2)乙醇慢性刺激组:分别给予25、50、100、200、400、800μmol/L乙醇,刺激24h或200 μ mol/L乙醇,刺激24、48、72 h; (3) EGTA处理组:200μ mol/L乙醇+ 0.5μmol/L EGTA,刺激24 h; (4) 2-APB处理组:200μmol/L乙醇+50μmol/L 2-APB,刺激24 h.细胞计数CCK8试剂盒检测细胞存活率;全自动生物化学分析仪检测HepG2细胞培养上清液ALT、AST漏出量;流式细胞仪检测HepG2细胞胞浆Ca2+浓度.荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测HepG2细胞中SOCs通道蛋白分子间质相互作用因子1及钙释放激活钙通道蛋白1的基因及蛋白表达.各组间均数的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验. 结果 50、100、200、400、800 μmol/L乙醇刺激24h使HepG2细胞的存活率分别降低为97.3％±2.9％、83.4％±3.3％、67.8％±4.4％、37.5％±3.0％、14.1％±4.9％组间比较,F=99.945,P＜0.01,细胞存活率呈浓度依赖性;细胞培养基上清液ALT漏出量分别增加为(14.2±2.8)、(17.7±3.2)、(20.0±2.6)、(21.6±1.3)、(24.9±1.7)U/L,组间比较,F=15.286,P＜0.01 ; AST漏出量分别增加为(72.0±4.7)、(91.6±7.4)、(107.3±11.4)、(116.5±13.4)、(128.9±7.1)U/L,组间比较,F=39.674,P＜0.01 ;使HepG2细胞的[Ca2+]i水平分别增高为正常对照组的(1.3±0.4)、(1.3±0.2)、(1.4±0.2)、(2.3±0.3)、(2.6±0.2) 倍,F=56.978,P＜0.01.EGTA、2-APB干预使200μmol/L乙醇刺激后的HepG2细胞[Ca2+]i水平分别降至正常对照组的(1.8±0.2)倍和(1.9±0.1)倍,t值分别为7.201和8.183,P值均＜0.01;同时将乙醇刺激后的细胞存活率分别增高至82.2％±3.9％和78.6％±1.5％,t值分别为6.692和6.124,P值均＜0.01);使细胞培养基上清液ALT漏出量分别降低至(16.4±2.0) U/L和(17.2±1.9)U/L,t值分别为7.145和6.352,JP值均＜ 0.01 ;AST漏出量分别降低至(86.4±8.8)U/L和(88.3±6.3) U/L,t值分别为9.337和8.704,P值均＜0.01.200μmol/L乙醇刺激明显增加HepG2细胞STIM1及Orai1的基因及蛋白表达量,且其表达增加持续至少72h. 结论 乙醇增高SOCs通道蛋白分子表达,增加SOCs介导的Ca2+内流,提示此可能是乙醇导致肝细胞[Ca2+]i增高及相关肝细胞损伤的重要分子机制.
目的 研究乙醇誘導肝細胞鈣超載的機製及鈣池操縱的鈣離子通道(SOCs)在其中的作用. 方法 使用濃度梯度的乙醇處理HepG2細胞,併觀察細胞外鈣離子螯閤劑乙二醇二乙醚二胺四乙痠(EGTA)及SOCs抑製劑2-APB對200μmol/L乙醇刺激的榦預效應.實驗分為:(1)正常對照組:燐痠鹽緩遲液刺激;(2)乙醇慢性刺激組:分彆給予25、50、100、200、400、800μmol/L乙醇,刺激24h或200 μ mol/L乙醇,刺激24、48、72 h; (3) EGTA處理組:200μ mol/L乙醇+ 0.5μmol/L EGTA,刺激24 h; (4) 2-APB處理組:200μmol/L乙醇+50μmol/L 2-APB,刺激24 h.細胞計數CCK8試劑盒檢測細胞存活率;全自動生物化學分析儀檢測HepG2細胞培養上清液ALT、AST漏齣量;流式細胞儀檢測HepG2細胞胞漿Ca2+濃度.熒光定量聚閤酶鏈反應及蛋白質印跡法檢測HepG2細胞中SOCs通道蛋白分子間質相互作用因子1及鈣釋放激活鈣通道蛋白1的基因及蛋白錶達.各組間均數的比較採用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗. 結果 50、100、200、400、800 μmol/L乙醇刺激24h使HepG2細胞的存活率分彆降低為97.3％±2.9％、83.4％±3.3％、67.8％±4.4％、37.5％±3.0％、14.1％±4.9％組間比較,F=99.945,P＜0.01,細胞存活率呈濃度依賴性;細胞培養基上清液ALT漏齣量分彆增加為(14.2±2.8)、(17.7±3.2)、(20.0±2.6)、(21.6±1.3)、(24.9±1.7)U/L,組間比較,F=15.286,P＜0.01 ; AST漏齣量分彆增加為(72.0±4.7)、(91.6±7.4)、(107.3±11.4)、(116.5±13.4)、(128.9±7.1)U/L,組間比較,F=39.674,P＜0.01 ;使HepG2細胞的[Ca2+]i水平分彆增高為正常對照組的(1.3±0.4)、(1.3±0.2)、(1.4±0.2)、(2.3±0.3)、(2.6±0.2) 倍,F=56.978,P＜0.01.EGTA、2-APB榦預使200μmol/L乙醇刺激後的HepG2細胞[Ca2+]i水平分彆降至正常對照組的(1.8±0.2)倍和(1.9±0.1)倍,t值分彆為7.201和8.183,P值均＜0.01;同時將乙醇刺激後的細胞存活率分彆增高至82.2％±3.9％和78.6％±1.5％,t值分彆為6.692和6.124,P值均＜0.01);使細胞培養基上清液ALT漏齣量分彆降低至(16.4±2.0) U/L和(17.2±1.9)U/L,t值分彆為7.145和6.352,JP值均＜ 0.01 ;AST漏齣量分彆降低至(86.4±8.8)U/L和(88.3±6.3) U/L,t值分彆為9.337和8.704,P值均＜0.01.200μmol/L乙醇刺激明顯增加HepG2細胞STIM1及Orai1的基因及蛋白錶達量,且其錶達增加持續至少72h. 結論 乙醇增高SOCs通道蛋白分子錶達,增加SOCs介導的Ca2+內流,提示此可能是乙醇導緻肝細胞[Ca2+]i增高及相關肝細胞損傷的重要分子機製.
목적 연구을순유도간세포개초재적궤제급개지조종적개리자통도(SOCs)재기중적작용. 방법 사용농도제도적을순처리HepG2세포,병관찰세포외개리자오합제을이순이을미이알사을산(EGTA)급SOCs억제제2-APB대200μmol/L을순자격적간예효응.실험분위:(1)정상대조조:린산염완충액자격;(2)을순만성자격조:분별급여25、50、100、200、400、800μmol/L을순,자격24h혹200 μ mol/L을순,자격24、48、72 h; (3) EGTA처리조:200μ mol/L을순+ 0.5μmol/L EGTA,자격24 h; (4) 2-APB처리조:200μmol/L을순+50μmol/L 2-APB,자격24 h.세포계수CCK8시제합검측세포존활솔;전자동생물화학분석의검측HepG2세포배양상청액ALT、AST루출량;류식세포의검측HepG2세포포장Ca2+농도.형광정량취합매련반응급단백질인적법검측HepG2세포중SOCs통도단백분자간질상호작용인자1급개석방격활개통도단백1적기인급단백표체.각조간균수적비교채용단인소방차분석혹독립양본t검험. 결과 50、100、200、400、800 μmol/L을순자격24h사HepG2세포적존활솔분별강저위97.3％±2.9％、83.4％±3.3％、67.8％±4.4％、37.5％±3.0％、14.1％±4.9％조간비교,F=99.945,P＜0.01,세포존활솔정농도의뢰성;세포배양기상청액ALT루출량분별증가위(14.2±2.8)、(17.7±3.2)、(20.0±2.6)、(21.6±1.3)、(24.9±1.7)U/L,조간비교,F=15.286,P＜0.01 ; AST루출량분별증가위(72.0±4.7)、(91.6±7.4)、(107.3±11.4)、(116.5±13.4)、(128.9±7.1)U/L,조간비교,F=39.674,P＜0.01 ;사HepG2세포적[Ca2+]i수평분별증고위정상대조조적(1.3±0.4)、(1.3±0.2)、(1.4±0.2)、(2.3±0.3)、(2.6±0.2) 배,F=56.978,P＜0.01.EGTA、2-APB간예사200μmol/L을순자격후적HepG2세포[Ca2+]i수평분별강지정상대조조적(1.8±0.2)배화(1.9±0.1)배,t치분별위7.201화8.183,P치균＜0.01;동시장을순자격후적세포존활솔분별증고지82.2％±3.9％화78.6％±1.5％,t치분별위6.692화6.124,P치균＜0.01);사세포배양기상청액ALT루출량분별강저지(16.4±2.0) U/L화(17.2±1.9)U/L,t치분별위7.145화6.352,JP치균＜ 0.01 ;AST루출량분별강저지(86.4±8.8)U/L화(88.3±6.3) U/L,t치분별위9.337화8.704,P치균＜0.01.200μmol/L을순자격명현증가HepG2세포STIM1급Orai1적기인급단백표체량,차기표체증가지속지소72h. 결론 을순증고SOCs통도단백분자표체,증가SOCs개도적Ca2+내류,제시차가능시을순도치간세포[Ca2+]i증고급상관간세포손상적중요분자궤제.
Objective To investigate the mechanism of ethanol-induced calcium overload in hepatocytes and the related role of store-operated calcium channels (SOCs).Methods HepG2 cells were treated an ethanol concentration gradient with or without intervention treatment with the extracellular calcium chelator EGTA or the SOCs inhibitor 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB).Effects on cell viability were assessed by the CCK8 assay.Effects on leakage of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were determined by automatic biochemical analyzer measurements of the culture supematants.Effects on cytoplasmic free Ca2+ concentration ([Ca2+]i) were accessed by detecting fluorescence intensity of the calcium indicator Fluo-3/AM with a flow cytometer.Effects on mRNA and protein expression levels of SOCs,stromal interacting factor 1 (STIM1),and calcium release-activated calcium channel protein 1 (Orai1) were evaluated by qPCR and westem blotting.Results The ethanol treatment produced dose-dependent reduction in cell viability (r =-0.985,P ＜ 0.01) and increases in leakage ofALT (F =15.286,P ＜ 0.01) and AST (F =39.674,P ＜ 0.01).Compared to untreated controls,the ethanol treatments of 25,50,100,200 and 400 mM induced significant increases in [Ca2+]i level (1.25 ± 0.36,1.31 ± 0.15,1.41 ± 0.18,2.29 ± 0.25,2.58 ± 0.19; F =15.286,P ＜ 0.01).Both intervention treatments,EGTA and 2-APB,significantly reduced the 200 mM ethanol treatment-induced [Ca2+]i increase (2.32 ±0.08 reduced to 1.79 ± 0.15 (t =7.201,P ＜ 0.01) and 1.86 ± 0.09 (t =8.183,P ＜ 0.01) respectively).EGTA and 2-APB also increased the ethanol-treated cells' viability and reduced the ALT and AST leakage.The 200 mM ethanol treatment stimulated both gene and protein expression of STIM1 and Orail,and the upregulation effect lasted at least 72 h after treatment.Conclusion Ethanol-induced dysregulation of SOCs may be an important molecular mechanism of ethanol-induced [Ca2+]i rise in hepatocytes and the related liver cell injury.
