生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2012年
5期
648-652
,共5页
邵振鲁%吴晓洁%林艳丽%熊福银%周艳荣%郑芸芸%李金钢%陈红星
邵振魯%吳曉潔%林豔麗%熊福銀%週豔榮%鄭蕓蕓%李金鋼%陳紅星
소진로%오효길%림염려%웅복은%주염영%정예예%리금강%진홍성
细菌人工染色体%缺口修复%乳清酸蛋白%人溶菌酶
細菌人工染色體%缺口脩複%乳清痠蛋白%人溶菌酶
세균인공염색체%결구수복%유청산단백%인용균매
目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达.方法:采用连续3步缺口修复的方法.首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体.然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9 kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起.结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的.结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法.
目的:構建一箇利用小鼠乳清痠蛋白(mWAP)基因座完整的上下遊調控序列指導人溶菌酶(hLYZ)基因組序列在乳腺內特異性高效錶達的mWAP-hLYZ雜閤基因座,實現人溶菌酶的高效錶達.方法:採用連續3步缺口脩複的方法.首先,以pBR322載體作為骨架,插入預先閤成的6箇同源臂序列,構成能夠連續進行3次缺口脩複的基因抓捕載體.然後在大腸桿菌內利用λ噬菌體Red同源重組繫統介導的同源重組方法:第一步,從含mWAP基因座的細菌人工染色體(BAC)上亞剋隆8 kb的mWAP基因3'耑完整側翼序列到抓捕載體上;第二步,從含hLYZ基因的BAC上亞剋隆5 kb的從起始密碼子(ATG)到終止密碼子(TAA)的hLYZ基因組序列;第三步,從mWAP BAC上亞剋隆9 kb的mWAP基因5'耑完整側翼序列,併使上述3箇片段在抓捕載體上自動無痕地連接在一起.結果:構建瞭全長約22 kb的mWAP-hLYZ雜閤基因座,經PCR擴增、限製性內切酶酶切和序列測定驗證,構建的雜閤基因座達到原mWAP基因座中mWAP基因組編碼序列從起始密碼子(ATG)到終止密碼子(TAA)完全被hLYZ基因組序列精確置換的目的.結論:通過連續3步缺口脩複構建雜閤mWAP-hLYZ基因座乳腺錶達載體,為乳腺生物反應器高效錶達人溶菌酶提供瞭可行的思路和方法.
목적:구건일개이용소서유청산단백(mWAP)기인좌완정적상하유조공서렬지도인용균매(hLYZ)기인조서렬재유선내특이성고효표체적mWAP-hLYZ잡합기인좌,실현인용균매적고효표체.방법:채용련속3보결구수복적방법.수선,이pBR322재체작위골가,삽입예선합성적6개동원비서렬,구성능구련속진행3차결구수복적기인조포재체.연후재대장간균내이용λ서균체Red동원중조계통개도적동원중조방법:제일보,종함mWAP기인좌적세균인공염색체(BAC)상아극륭8 kb적mWAP기인3'단완정측익서렬도조포재체상;제이보,종함hLYZ기인적BAC상아극륭5 kb적종기시밀마자(ATG)도종지밀마자(TAA)적hLYZ기인조서렬;제삼보,종mWAP BAC상아극륭9 kb적mWAP기인5'단완정측익서렬,병사상술3개편단재조포재체상자동무흔지련접재일기.결과:구건료전장약22 kb적mWAP-hLYZ잡합기인좌,경PCR확증、한제성내절매매절화서렬측정험증,구건적잡합기인좌체도원mWAP기인좌중mWAP기인조편마서렬종기시밀마자(ATG)도종지밀마자(TAA)완전피hLYZ기인조서렬정학치환적목적.결론:통과련속3보결구수복구건잡합mWAP-hLYZ기인좌유선표체재체,위유선생물반응기고효표체인용균매제공료가행적사로화방법.
