CAJ | 학술논문

与传统克隆相比,手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物.小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用.本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞,在含细胞松弛素(Cytochalasin B,CB)和链蛋白酶(Pronase)及2％血清的M199 hepes缓冲液滴(CBMP)中消化透明带并切割去核,电融合后1h,重构胚置于含SrC12及CB(5 μg/mL)的无钙体外培养液(Ca2+-free IVC)中激活6h,体外培养液(IVC)中清洗3遍后,移入WOW系统培养,培养至小鼠HMC囊胚阶段.研究发现:1)CBMP液中Pronase的浓度相比20 μg/mL和100μg/mL,卵母细胞透明带在10 μg/mL组需要更长时间消化至消失,较有利于操作;2)直流电(DC)80 V,持续40μs,融合率达60％.3)含10 mmoL/L SrCl2的化学激活液处理的重构胚与5mmol/L组相比,囊胚更高(29±3％∶13±3％,P＜0.05),差异显著;4)两种体外培养液,CZB与mPZM,在IVC囊胚率上无显著差异(29±3％:24±5％,P＞0.05),而使用CZB可获得较高的囊胚率.本实验首次采用HMC方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎,通过摸索透明带消化时间、电激活参数、化学激活试剂及培养液,尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法,并取得了初步成果,技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究.
여전통극륭상비,수공극륭사용교위간단적의기설비화기술조작즉가생산극륭동물.소서작위모식실험동물재다영역득이응용.본연구중채용잡교태서세포계제공핵공체세포,재함세포송이소(Cytochalasin B,CB)화련단백매(Pronase)급2％혈청적M199 hepes완충액적(CBMP)중소화투명대병절할거핵,전융합후1h,중구배치우함SrC12급CB(5 μg/mL)적무개체외배양액(Ca2+-free IVC)중격활6h,체외배양액(IVC)중청세3편후,이입WOW계통배양,배양지소서HMC낭배계단.연구발현:1)CBMP액중Pronase적농도상비20 μg/mL화100μg/mL,란모세포투명대재10 μg/mL조수요경장시간소화지소실,교유리우조작;2)직류전(DC)80 V,지속40μs,융합솔체60％.3)함10 mmoL/L SrCl2적화학격활액처리적중구배여5mmol/L조상비,낭배경고(29±3％∶13±3％,P＜0.05),차이현저;4)량충체외배양액,CZB여mPZM,재IVC낭배솔상무현저차이(29±3％:24±5％,P＞0.05),이사용CZB가획득교고적낭배솔.본실험수차채용HMC방법체외조건하생산소서극륭배태,통과모색투명대소화시간、전격활삼수、화학격활시제급배양액,상시소서체외생산극륭배태적신방법,병취득료초보성과,기술우화급효솔제고문제잉수요경진일보적연구.