CAJ | 학술논문

【目的】构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域TAT的黑色素瘤相关基因MAGE－A3融合蛋白TAT－MAGE－A3－EGFP，并观察其生物学功能，【方法】1）构建质粒pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、对照组pET28a－MAGE－A3－EGFP和pET28a－TAT－EGFP原核表达载体，在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，经SDS－PAGE电泳和Western Blot鉴定并通过Ni＋柱纯化获得TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP三种融合蛋白；2）动态荧光显微镜观察MAGE－A3、TAT－MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP三种融合蛋白在细胞中的不同分布，流式细胞术观察三种融合蛋白穿膜效率的差异。【结果】1）成功构建了pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、pET28a－MAGE－A3－EGFP和pET28a－TAT－EGFP原核表达载体，并获得了TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP和TAT－EGFP融合蛋白。2）动态荧光显微镜和流式细胞术显示TAT－MAGE －A3－EGFP与MAGE－A3－EGFP相比能更高效地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核，且与TAT－EGFP相比穿膜效率区别不大。【结论】TAT－MAGE－A3－EGFP融合蛋白可在原核表达系统中高效表达，并具有高效穿透细胞膜能力，且带有PTD结构的融合蛋白穿膜能力与分子量无直接关系。
【목적】구건、표체병순화함유단백전도결구역TAT적흑색소류상관기인MAGE－A3융합단백TAT－MAGE－A3－EGFP，병관찰기생물학공능，【방법】1）구건질립pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、대조조pET28a－MAGE－A3－EGFP화pET28a－TAT－EGFP원핵표체재체，재대장애희균BL21（DE3）중표체，경SDS－PAGE전영화Western Blot감정병통과Ni＋주순화획득TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP삼충융합단백；2）동태형광현미경관찰MAGE－A3、TAT－MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP삼충융합단백재세포중적불동분포，류식세포술관찰삼충융합단백천막효솔적차이。【결과】1）성공구건료pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、pET28a－MAGE－A3－EGFP화pET28a－TAT－EGFP원핵표체재체，병획득료TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP화TAT－EGFP융합단백。2）동태형광현미경화류식세포술현시TAT－MAGE －A3－EGFP여MAGE－A3－EGFP상비능경고효지천과세포막진입세포내，병정위우세포질화세포핵，차여TAT－EGFP상비천막효솔구별불대。【결론】TAT－MAGE－A3－EGFP융합단백가재원핵표체계통중고효표체，병구유고효천투세포막능력，차대유PTD결구적융합단백천막능력여분자량무직접관계。