CAJ | 학술논문

目的：有研究表明硫化氢（hydrogen sulfide， H2S）能减少缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡，但确切机制不清。文中旨在研究心肌细胞缺氧／复氧（ hypoxia／reoxygenation ， HR）损伤中，H2 S能否通过调节miR-455的表达和减少内质网应激（ endoplasmic reticulum stress ， ERS）介导细胞凋亡发挥心肌保护作用。方法原代培养新生SD大鼠心肌细胞，建立心肌细胞HR模型。实验分组：对照组（心肌细胞正常培养27 h）；HR 组（将心肌细胞更换不含血清的DMEM液后进行HR处理）；H 2S 保护组[心肌细胞缺氧前30 min 给予40μmol／L的NaHS（ H2 S前体）预处理，其余处理同HR组]。采用MTT法检测细胞活力，全自动化学分析法检测培养液LDH漏出量，流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率，RT-PCR法、蛋白印记法分别检测miR-455及ERS介导细胞凋亡信号通路的标志物葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78， Grp78）和caspase-12的mRNA、蛋白的表达。为检测miR-455是否参与H2 S抑制ERS介导的细胞凋亡，将心肌细胞又分为3组，阴性对照组（转染miR-455阴性对照片段24 h）；miR-455模拟剂组（转染miR-455模拟剂24 h），miR-455拮抗剂组（转染miR-455拮抗剂24 h），分别给予40μmol／L的NaHS预处理，再进行HR处理，检测Grp78、caspase-12的表达。结果与HR组比较，H2 S保护组可增加HR损伤的心肌细胞活力[（67．02±6．90）％vs （29．27±5．66）％， P＜0．05]，减少LDH漏出量[（91．33±10．63）U／L vs （168．17±15．38）U／L， P＜0．05]，同时降低细胞凋亡率[（13．98±1．90）％vs （24．31±2．79）％， P＜0．05]。与HR组比较，H2S保护组可降低HR损伤后细胞Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA的表达（ P＜0．05）。与阴性对照组比较，miR-455模拟剂组Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA表达显著升高，而miR-455拮抗剂组表达则显著下降（ P＜0．05）。结论 H2 S可通过调节miR-455的表达水平，减少HR损伤心肌细胞的ERS介导的细胞凋亡，发挥其对心肌的保护作用。目的：有研究錶明硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）能減少缺血再灌註損傷心肌細胞的凋亡，但確切機製不清。文中旨在研究心肌細胞缺氧／複氧（ hypoxia／reoxygenation ， HR）損傷中，H2 S能否通過調節miR-455的錶達和減少內質網應激（ endoplasmic reticulum stress ， ERS）介導細胞凋亡髮揮心肌保護作用。方法原代培養新生SD大鼠心肌細胞，建立心肌細胞HR模型。實驗分組：對照組（心肌細胞正常培養27 h）；HR 組（將心肌細胞更換不含血清的DMEM液後進行HR處理）；H 2S 保護組[心肌細胞缺氧前30 min 給予40μmol／L的NaHS（ H2 S前體）預處理，其餘處理同HR組]。採用MTT法檢測細胞活力，全自動化學分析法檢測培養液LDH漏齣量，流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率，RT-PCR法、蛋白印記法分彆檢測miR-455及ERS介導細胞凋亡信號通路的標誌物葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78， Grp78）和caspase-12的mRNA、蛋白的錶達。為檢測miR-455是否參與H2 S抑製ERS介導的細胞凋亡，將心肌細胞又分為3組，陰性對照組（轉染miR-455陰性對照片段24 h）；miR-455模擬劑組（轉染miR-455模擬劑24 h），miR-455拮抗劑組（轉染miR-455拮抗劑24 h），分彆給予40μmol／L的NaHS預處理，再進行HR處理，檢測Grp78、caspase-12的錶達。結果與HR組比較，H2 S保護組可增加HR損傷的心肌細胞活力[（67．02±6．90）％vs （29．27±5．66）％， P＜0．05]，減少LDH漏齣量[（91．33±10．63）U／L vs （168．17±15．38）U／L， P＜0．05]，同時降低細胞凋亡率[（13．98±1．90）％vs （24．31±2．79）％， P＜0．05]。與HR組比較，H2S保護組可降低HR損傷後細胞Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA的錶達（ P＜0．05）。與陰性對照組比較，miR-455模擬劑組Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA錶達顯著升高，而miR-455拮抗劑組錶達則顯著下降（ P＜0．05）。結論 H2 S可通過調節miR-455的錶達水平，減少HR損傷心肌細胞的ERS介導的細胞凋亡，髮揮其對心肌的保護作用。
목적：유연구표명류화경（hydrogen sulfide， H2S）능감소결혈재관주손상심기세포적조망，단학절궤제불청。문중지재연구심기세포결양／복양（ hypoxia／reoxygenation ， HR）손상중，H2 S능부통과조절miR-455적표체화감소내질망응격（ endoplasmic reticulum stress ， ERS）개도세포조망발휘심기보호작용。방법원대배양신생SD대서심기세포，건립심기세포HR모형。실험분조：대조조（심기세포정상배양27 h）；HR 조（장심기세포경환불함혈청적DMEM액후진행HR처리）；H 2S 보호조[심기세포결양전30 min 급여40μmol／L적NaHS（ H2 S전체）예처리，기여처리동HR조]。채용MTT법검측세포활력，전자동화학분석법검측배양액LDH루출량，류식세포의검측심기세포조망솔，RT-PCR법、단백인기법분별검측miR-455급ERS개도세포조망신호통로적표지물포도당조절단백78（glucose regulated protein 78， Grp78）화caspase-12적mRNA、단백적표체。위검측miR-455시부삼여H2 S억제ERS개도적세포조망，장심기세포우분위3조，음성대조조（전염miR-455음성대조편단24 h）；miR-455모의제조（전염miR-455모의제24 h），miR-455길항제조（전염miR-455길항제24 h），분별급여40μmol／L적NaHS예처리，재진행HR처리，검측Grp78、caspase-12적표체。결과여HR조비교，H2 S보호조가증가HR손상적심기세포활력[（67．02±6．90）％vs （29．27±5．66）％， P＜0．05]，감소LDH루출량[（91．33±10．63）U／L vs （168．17±15．38）U／L， P＜0．05]，동시강저세포조망솔[（13．98±1．90）％vs （24．31±2．79）％， P＜0．05]。여HR조비교，H2S보호조가강저HR손상후세포Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA적표체（ P＜0．05）。여음성대조조비교，miR-455모의제조Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA표체현저승고，이miR-455길항제조표체칙현저하강（ P＜0．05）。결론 H2 S가통과조절miR-455적표체수평，감소HR손상심기세포적ERS개도적세포조망，발휘기대심기적보호작용。
Objective The protective effect of hydrogen sulfide (H2 S) against myocardial ischemia/reperfusion ( IR) injury via anti-apoptotic signaling is well established , but the underlying mechanism remains unclear .This study was to investigate whether H 2 S could protect cardiomyocytes from endoplasmic reticulum stress ( ERS)-mediated apoptosis in hypoxia/reoxygenation ( HR) injury by regulating the expression of microRNA-455 ( miR-455 ) . Methods Cardiomyocytes from neonatal SD rats were primarily cultured and the model of HR injury was established .The cardiomyocytes were divided into a control group (normally cultured for 27 hours), an HR group (subjected to HR injury), and an H2S protection group (pretreated with the precursor of H2S NaHS at 40 μmol/L at 30 min before HR treatment followed by the same procedure as in the HR group ) .The cell viability was monitored by MTT , the release of lactate de-hydrogenase ( LDH) in the culture supernatant measured by full-automatic chemical analysis , and the apoptosis rate of the cardiomyo-cytes detected by flow cytometry .The mRNA and protein expressions of Grp 78 and caspase-12 were determined by real-time RT-PCR and Western bot .To verify whether miR-455 was involved in the ERS-mediated apoptosis of the cardiomyocytes , the cells were subjec-ted to HR after transfected with miR-455 mimic or anti-miR-455 oligonucleotide (AMO) for 24 hours, followed by detection of the ex-pressions of Grp78 and caspase-12. Results After HR injury, the H2 S protection group showed an enhanced viability of the cardio-myocytes in comparison with the control group ([67.02 ±6.90] vs [29.27 ±5.66] %), an decreased LDH release ([91.33 ± 10.63] vs [168.17 ±15.38] U/L), and a reduced rate of cell apoptosis ([13.98 ±1.90] vs [24.31 ±2.79] %).H2 S pretreat-ment significantly downregulated the mRNA and protein expressions of Grp 78 and caspase-12 (1.66 ±0.39 vs 2.56 ±0.34;1.75 ± 0.32 vs 2.54 ±0.48;2.01 ±0.45 vs 3.26 ±0.34;1.85 ±0.52 vs 3.21 ±0.84, P<0.05).The mRNA and protein expressions of Grp78 and caspase-12 were evidently increased after transfection with miR-455 mimic (3.56 ±0.37 vs 1.00 ±0.00;3.61 ±0.41 vs 1.00 ±0.00;2.87 ±0.38 vs 1.00 ±0.00;2.98 ±0.49 vs 1.00 ±0.00), but remarkably decreased after transfection with miR-455 AMO (0.62 ±0.16 vs 1.00 ±0.00;0.65 ±0.13 vs 1.00 ±0.00;0.54 ±0.13 vs 1.00 ±0.00;0.62 ±0.16 vs 1.00 ±0.00, P<0.05). Conclusion H2S could protect cardiomyocytes from HR injury by regulating the expression of miR-455 and reducing ERS-mediated cell apoptosis .