中国生化药物杂志
中國生化藥物雜誌
중국생화약물잡지
CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMICAL PHARMACEUTICS
2014年
8期
38-42
,共5页
免疫避孕%疫苗%富含半胱氨酸分泌蛋白-1%DNA%生育
免疫避孕%疫苗%富含半胱氨痠分泌蛋白-1%DNA%生育
면역피잉%역묘%부함반광안산분비단백-1%DNA%생육
immunocontraception%vaccine%cysteine-rich secretory protein-1%DNA%fertility
目的 通过构建载Crisp-1 DNA疫苗的壳聚糖纳米粒,评估真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1的免疫避孕效应及壳聚糖纳米粒作为DNA避孕疫苗载体的有效性和安全性.方法 复凝法制备质粒浓度分别为50、100、200 μg/mL的壳聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1纳米粒(CS/DNA NPs),紫外分光光度仪检测不同质粒浓度下DNA的包埋率.于透射电子显微镜(TEM)下观察纳米粒形态,用纳米粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径、多分散度和zeta电位.1％琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖纳米粒与质粒的结合力及在核酸酶条件下壳聚糖纳米粒对质粒DNA的保护作用.然后将载Crisp-1DNA疫苗的壳聚糖纳米粒直接转染至COS-7细胞,与脂质体比较其细胞毒性,细胞转染分为4组:CS/DNA纳米复合物转染组:直接加入CS/DNA复合物;脂质体转染组:按脂质体转染法转染质粒pcDNA3.1-Crisp-1;pcDNA3.1空载体组:转染过程中加入空载体pcDNA3.1;空白对照组:不给予任何干预措施.并用实时荧光定量PCR和间接免疫荧光细胞化学法鉴定转染后mCrisp-1在COS-7细胞内的表达.结果 采用紫外分光光度仪检测壳聚糖纳米粒对不同浓度质粒DNA的包埋率,结果显示,3种浓度下质粒包埋率均达90％以上,但当质粒浓度为100 μg/mL时,壳聚糖对质粒DNA的包埋率最高(94.09±0.17)％,且与另2组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).透射电子显微镜下观察发现CS/DNA纳米复合物形态较为规则,近球形,大小较均一,直径多在150～200 nm之间,散在分布,分散性好.纳米粒度分析仪测定结果显示,纳米粒平均直径为189.3 nm,多分散指数为0.459,粒径分布范围较窄.Zeta电位约为+0.2 mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果显示,壳聚糖与DNA疫苗结合后使质粒DNA完全阻滞于加样孔中,并可保护质粒DNA不受核酸酶降解.MTT试验结果显示CS/DNA纳米复合物组细胞存活率与裸质粒组相比无明显差异,但显著高于脂质体组(P＜0.01).将未处理的正常COS-7细胞和经不同方式转染pcDNA3.1-Crisp-1的COS-7细胞分别行间接免疫荧光检测,结果显示,无论是用脂质体Lipofectamine 2000TM介导转染的COS-7细胞还是CS/DNA纳米复合物直接转染的COS-7细胞中均可看到明亮的绿色荧光,而未处理组和pcDNA3.1空载体转染组细胞未见绿色荧光,表明壳聚糖可有效的介导Crisp-1DNA疫苗在真核细胞中表达.qRT-PCR检测经不同方法转染后COS-7细胞中Crisp-1 mRNA的表达水平,结果分析显示,空白对照组和pcDNA3.1空载体组未检测到Crisp-1 mRNA表达,脂质体Lipofectamine 2000TM组Crisp-1mRNA表达水平略高于CS/DNA纳米复合物转染组,但差异无统计学意义.结论 壳聚糖纳米粒可显著提高pcDNA3.1-Crisp-1 DNA疫苗的免疫效应,并具有良好的安全性.
目的 通過構建載Crisp-1 DNA疫苗的殼聚糖納米粒,評估真覈錶達質粒pcDNA3.1-Crisp-1的免疫避孕效應及殼聚糖納米粒作為DNA避孕疫苗載體的有效性和安全性.方法 複凝法製備質粒濃度分彆為50、100、200 μg/mL的殼聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1納米粒(CS/DNA NPs),紫外分光光度儀檢測不同質粒濃度下DNA的包埋率.于透射電子顯微鏡(TEM)下觀察納米粒形態,用納米粒度分析儀測定納米粒的平均粒徑、多分散度和zeta電位.1％瓊脂糖凝膠電泳分析殼聚糖納米粒與質粒的結閤力及在覈痠酶條件下殼聚糖納米粒對質粒DNA的保護作用.然後將載Crisp-1DNA疫苗的殼聚糖納米粒直接轉染至COS-7細胞,與脂質體比較其細胞毒性,細胞轉染分為4組:CS/DNA納米複閤物轉染組:直接加入CS/DNA複閤物;脂質體轉染組:按脂質體轉染法轉染質粒pcDNA3.1-Crisp-1;pcDNA3.1空載體組:轉染過程中加入空載體pcDNA3.1;空白對照組:不給予任何榦預措施.併用實時熒光定量PCR和間接免疫熒光細胞化學法鑒定轉染後mCrisp-1在COS-7細胞內的錶達.結果 採用紫外分光光度儀檢測殼聚糖納米粒對不同濃度質粒DNA的包埋率,結果顯示,3種濃度下質粒包埋率均達90％以上,但噹質粒濃度為100 μg/mL時,殼聚糖對質粒DNA的包埋率最高(94.09±0.17)％,且與另2組相比差異具有統計學意義(P＜0.05).透射電子顯微鏡下觀察髮現CS/DNA納米複閤物形態較為規則,近毬形,大小較均一,直徑多在150～200 nm之間,散在分佈,分散性好.納米粒度分析儀測定結果顯示,納米粒平均直徑為189.3 nm,多分散指數為0.459,粒徑分佈範圍較窄.Zeta電位約為+0.2 mV.1％瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,殼聚糖與DNA疫苗結閤後使質粒DNA完全阻滯于加樣孔中,併可保護質粒DNA不受覈痠酶降解.MTT試驗結果顯示CS/DNA納米複閤物組細胞存活率與裸質粒組相比無明顯差異,但顯著高于脂質體組(P＜0.01).將未處理的正常COS-7細胞和經不同方式轉染pcDNA3.1-Crisp-1的COS-7細胞分彆行間接免疫熒光檢測,結果顯示,無論是用脂質體Lipofectamine 2000TM介導轉染的COS-7細胞還是CS/DNA納米複閤物直接轉染的COS-7細胞中均可看到明亮的綠色熒光,而未處理組和pcDNA3.1空載體轉染組細胞未見綠色熒光,錶明殼聚糖可有效的介導Crisp-1DNA疫苗在真覈細胞中錶達.qRT-PCR檢測經不同方法轉染後COS-7細胞中Crisp-1 mRNA的錶達水平,結果分析顯示,空白對照組和pcDNA3.1空載體組未檢測到Crisp-1 mRNA錶達,脂質體Lipofectamine 2000TM組Crisp-1mRNA錶達水平略高于CS/DNA納米複閤物轉染組,但差異無統計學意義.結論 殼聚糖納米粒可顯著提高pcDNA3.1-Crisp-1 DNA疫苗的免疫效應,併具有良好的安全性.
목적 통과구건재Crisp-1 DNA역묘적각취당납미립,평고진핵표체질립pcDNA3.1-Crisp-1적면역피잉효응급각취당납미립작위DNA피잉역묘재체적유효성화안전성.방법 복응법제비질립농도분별위50、100、200 μg/mL적각취당-pcDNA3.1-Crisp-1납미립(CS/DNA NPs),자외분광광도의검측불동질립농도하DNA적포매솔.우투사전자현미경(TEM)하관찰납미립형태,용납미립도분석의측정납미립적평균립경、다분산도화zeta전위.1％경지당응효전영분석각취당납미립여질립적결합력급재핵산매조건하각취당납미립대질립DNA적보호작용.연후장재Crisp-1DNA역묘적각취당납미립직접전염지COS-7세포,여지질체비교기세포독성,세포전염분위4조:CS/DNA납미복합물전염조:직접가입CS/DNA복합물;지질체전염조:안지질체전염법전염질립pcDNA3.1-Crisp-1;pcDNA3.1공재체조:전염과정중가입공재체pcDNA3.1;공백대조조:불급여임하간예조시.병용실시형광정량PCR화간접면역형광세포화학법감정전염후mCrisp-1재COS-7세포내적표체.결과 채용자외분광광도의검측각취당납미립대불동농도질립DNA적포매솔,결과현시,3충농도하질립포매솔균체90％이상,단당질립농도위100 μg/mL시,각취당대질립DNA적포매솔최고(94.09±0.17)％,차여령2조상비차이구유통계학의의(P＜0.05).투사전자현미경하관찰발현CS/DNA납미복합물형태교위규칙,근구형,대소교균일,직경다재150～200 nm지간,산재분포,분산성호.납미립도분석의측정결과현시,납미립평균직경위189.3 nm,다분산지수위0.459,립경분포범위교착.Zeta전위약위+0.2 mV.1％경지당응효전영결과현시,각취당여DNA역묘결합후사질립DNA완전조체우가양공중,병가보호질립DNA불수핵산매강해.MTT시험결과현시CS/DNA납미복합물조세포존활솔여라질립조상비무명현차이,단현저고우지질체조(P＜0.01).장미처리적정상COS-7세포화경불동방식전염pcDNA3.1-Crisp-1적COS-7세포분별행간접면역형광검측,결과현시,무론시용지질체Lipofectamine 2000TM개도전염적COS-7세포환시CS/DNA납미복합물직접전염적COS-7세포중균가간도명량적록색형광,이미처리조화pcDNA3.1공재체전염조세포미견록색형광,표명각취당가유효적개도Crisp-1DNA역묘재진핵세포중표체.qRT-PCR검측경불동방법전염후COS-7세포중Crisp-1 mRNA적표체수평,결과분석현시,공백대조조화pcDNA3.1공재체조미검측도Crisp-1 mRNA표체,지질체Lipofectamine 2000TM조Crisp-1mRNA표체수평략고우CS/DNA납미복합물전염조,단차이무통계학의의.결론 각취당납미립가현저제고pcDNA3.1-Crisp-1 DNA역묘적면역효응,병구유량호적안전성.
