畜牧与兽医
畜牧與獸醫
축목여수의
ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
2015年
2期
74-77
,共4页
猪胞内劳森氏菌%实时定量PCR%检测
豬胞內勞森氏菌%實時定量PCR%檢測
저포내로삼씨균%실시정량PCR%검측
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为了建立用于检测导致猪增生性肠炎(PPE)的胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)的荧光定量PCR方法,依据GenBank中登录的LI基因组aspA序列,应用分子生物学软件优化设计1对特异性引物,经PCR扩增出300 bp的目的片段.产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验.结果显示:建立的检测方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,r2=0.997 9,产物TM在85.0～85.3℃之间,灵敏度为17.5个拷贝/μL,特异性和重复性较好,可用于临床PPE的诊断.本试验成功建立了检测PPE的SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR方法,为LI的早期鉴别诊断以及PPE的致病机理研究提供了技术支持,也为PPE分子诊断试剂盒的研制奠定了技术基础.
為瞭建立用于檢測導緻豬增生性腸炎(PPE)的胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis,LI)的熒光定量PCR方法,依據GenBank中登錄的LI基因組aspA序列,應用分子生物學軟件優化設計1對特異性引物,經PCR擴增齣300 bp的目的片段.產物經迴收與pMD18-T Vector連接後轉化到基因工程菌DH5α中,提取重組質粒,經測序鑒定後,作為暘性模闆建立SYBR-Green I熒光定量PCR標準麯線,併進行敏感性試驗、特異性試驗和重複性試驗.結果顯示:建立的檢測方法標準麯線循環閾值與模闆濃度呈良好的線性關繫,r2=0.997 9,產物TM在85.0～85.3℃之間,靈敏度為17.5箇拷貝/μL,特異性和重複性較好,可用于臨床PPE的診斷.本試驗成功建立瞭檢測PPE的SYBR-Green Ⅰ熒光定量PCR方法,為LI的早期鑒彆診斷以及PPE的緻病機理研究提供瞭技術支持,也為PPE分子診斷試劑盒的研製奠定瞭技術基礎.
위료건립용우검측도치저증생성장염(PPE)적포내로삼균(Lawsonia intracellularis,LI)적형광정량PCR방법,의거GenBank중등록적LI기인조aspA서렬,응용분자생물학연건우화설계1대특이성인물,경PCR확증출300 bp적목적편단.산물경회수여pMD18-T Vector련접후전화도기인공정균DH5α중,제취중조질립,경측서감정후,작위양성모판건립SYBR-Green I형광정량PCR표준곡선,병진행민감성시험、특이성시험화중복성시험.결과현시:건립적검측방법표준곡선순배역치여모판농도정량호적선성관계,r2=0.997 9,산물TM재85.0～85.3℃지간,령민도위17.5개고패/μL,특이성화중복성교호,가용우림상PPE적진단.본시험성공건립료검측PPE적SYBR-Green Ⅰ형광정량PCR방법,위LI적조기감별진단이급PPE적치병궤리연구제공료기술지지,야위PPE분자진단시제합적연제전정료기술기출.
