CAJ | 학술논문

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达.根据GenBank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体.将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-Zs-Green1,构建pL VX-OCT4 A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确.经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达.应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响.结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达(1.43±0.25)×108 U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP+细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05).结论:成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株.
본연구지재구건공표체인OCT4A여록색형광단백(GFP)만병독재체pLVX-OCT4A-ZsGreen1,병통과감염획득은정표체중조질립적백혈병K562세포계,관찰OCT4A재기중적표체.근거GenBank수거고제공적OCT4A mRNA서렬,합성편마mRNA기인적특이성인물서렬,통과RT-PCR기술확증출OCT4A전장편단,극륭지pCR-Blunt재체.장OCT4A DNA편단매절회수후극륭지경EcoR1매절선성화적만병독재체pLVX-IRES-Zs-Green1,구건pL VX-OCT4 A-ZsGreen1만병독중조질립,이용측서감정소구건적중조재체시부정학.경삼질립포장계통포장후획득고적도만병독과립병감염인백혈병세포계K562,통과류식세포의분선획득은정표체적백혈병세포계,응용Real-time PCR화Western blot방법분별검측은정전염세포계적OCT4A mRNA화OCT4A단백표체.응용CCK-8법화평판세포극륭형성시험측정OCT4A대K562세포증식능력적영향.결과표명,경한제성내절매검측급기인측서증실성공구건료휴대OCT4A기인적중조만병독;포장병독과립초속리심후병독적도체(1.43±0.25)×108 U/ml;병독감염K562세포후경류식세포의분선획득GFP+세포,실시정량PCR급Western blot증실병독감염후OCT4A기인급단백적표체가유효상조;CCK-8법급평판집락형성시험현시병독감염적K562세포체외증식활성명현승고,여대조조상비균유통계학차이(P＜0.05).결론:성공구건료표체OCT4A기인적만병독재체,병차획득가은정상조OCT4A표체적K562세포주.