CAJ | 학술논문

目的:通过Fibronectin介导进行差别粘附法筛选出入黄韧带干细胞并进行鉴定,探讨其作为组织工程种子细胞的可行性.方法:从椎间孔镜或椎间盘镜微创手术中获取10例人黄韧带标本,机械-酶消化法联合获取原代细胞,扩增第二代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶.流式细胞仪检测细胞表面特异性标志物.免疫组化方法测定干细胞表达相关特异性蛋白.使用干细胞诱导培养基(实验组)向成骨、成脂、成软骨多向诱导分化,使用常规生长培养基培养者作为阴性对照(对照组),分别行茜素红染色、油红O染色、阿利辛兰染色鉴定.PT-PCR检测成骨、成脂肪、成软骨基因表达.取同一患者的髂骨骨髓提取骨髓间充质干细胞,统计学分析黄韧带干细胞与骨髓间充质干细胞的细胞周期、增殖能力和干性基因表达差异.结果:原代细胞形态呈三角形或多角形,经Fibronectin介导粘附培养后形态比较均一,呈长梭形克隆群.流式细胞仪检测筛选后的黄韧带干细胞CD90、CD73阳性率＞96.8％,CD105阳性率＞95.9％,而stro-1为阴性.实验组茜素红染色呈强阳性,油红O染色可见大小不等脂滴呈红色,阿利辛兰染色大量蛋白聚糖聚集呈蓝色,对照组均为阴性.PT-PCR测定实验组成骨基因(OC、ALP、RUNX-2)、成脂肪基因(LPL、APP、PPA R2)、成软骨基因(COLⅡ、AGG、SOX9)显著上调,其中RUNX-2在对照组有低水平表达.免疫组化显示黄韧带干细胞和骨髓间充质干细胞均表达a-SMA、Ⅰ型胶原、纤连蛋白,但均不表达Ⅱ型胶原.两种干细胞均超过80％的细胞比例处于G0/G1期提示都有很强自我更新能力(P＞0.05).CCK-8检测不同时间点两种细胞的增殖能力,在第1～10天时OD值逐渐增加,第10～14天达稳定状态,二者有相似的增殖能力(P＞0.05).两种干细胞均表达干性基因NONAG、OCT-4、SOX2,组间差异无显著性(P＞0.05).结论:通过Fibronectin差别粘附筛选法可有效筛选纯化出黄韧带干细胞,其可向成骨、成脂、成软骨多向分化,为组织工程技术治疗退变椎间盘提供了新的种子细胞. 目的:通過Fibronectin介導進行差彆粘附法篩選齣入黃韌帶榦細胞併進行鑒定,探討其作為組織工程種子細胞的可行性.方法:從椎間孔鏡或椎間盤鏡微創手術中穫取10例人黃韌帶標本,機械-酶消化法聯閤穫取原代細胞,擴增第二代後接種于Fibronectin包被過的培養瓶.流式細胞儀檢測細胞錶麵特異性標誌物.免疫組化方法測定榦細胞錶達相關特異性蛋白.使用榦細胞誘導培養基(實驗組)嚮成骨、成脂、成軟骨多嚮誘導分化,使用常規生長培養基培養者作為陰性對照(對照組),分彆行茜素紅染色、油紅O染色、阿利辛蘭染色鑒定.PT-PCR檢測成骨、成脂肪、成軟骨基因錶達.取同一患者的髂骨骨髓提取骨髓間充質榦細胞,統計學分析黃韌帶榦細胞與骨髓間充質榦細胞的細胞週期、增殖能力和榦性基因錶達差異.結果:原代細胞形態呈三角形或多角形,經Fibronectin介導粘附培養後形態比較均一,呈長梭形剋隆群.流式細胞儀檢測篩選後的黃韌帶榦細胞CD90、CD73暘性率＞96.8％,CD105暘性率＞95.9％,而stro-1為陰性.實驗組茜素紅染色呈彊暘性,油紅O染色可見大小不等脂滴呈紅色,阿利辛蘭染色大量蛋白聚糖聚集呈藍色,對照組均為陰性.PT-PCR測定實驗組成骨基因(OC、ALP、RUNX-2)、成脂肪基因(LPL、APP、PPA R2)、成軟骨基因(COLⅡ、AGG、SOX9)顯著上調,其中RUNX-2在對照組有低水平錶達.免疫組化顯示黃韌帶榦細胞和骨髓間充質榦細胞均錶達a-SMA、Ⅰ型膠原、纖連蛋白,但均不錶達Ⅱ型膠原.兩種榦細胞均超過80％的細胞比例處于G0/G1期提示都有很彊自我更新能力(P＞0.05).CCK-8檢測不同時間點兩種細胞的增殖能力,在第1～10天時OD值逐漸增加,第10～14天達穩定狀態,二者有相似的增殖能力(P＞0.05).兩種榦細胞均錶達榦性基因NONAG、OCT-4、SOX2,組間差異無顯著性(P＞0.05).結論:通過Fibronectin差彆粘附篩選法可有效篩選純化齣黃韌帶榦細胞,其可嚮成骨、成脂、成軟骨多嚮分化,為組織工程技術治療退變椎間盤提供瞭新的種子細胞.
목적:통과Fibronectin개도진행차별점부법사선출입황인대간세포병진행감정,탐토기작위조직공정충자세포적가행성.방법:종추간공경혹추간반경미창수술중획취10례인황인대표본,궤계-매소화법연합획취원대세포,확증제이대후접충우Fibronectin포피과적배양병.류식세포의검측세포표면특이성표지물.면역조화방법측정간세포표체상관특이성단백.사용간세포유도배양기(실험조)향성골、성지、성연골다향유도분화,사용상규생장배양기배양자작위음성대조(대조조),분별행천소홍염색、유홍O염색、아리신란염색감정.PT-PCR검측성골、성지방、성연골기인표체.취동일환자적가골골수제취골수간충질간세포,통계학분석황인대간세포여골수간충질간세포적세포주기、증식능력화간성기인표체차이.결과:원대세포형태정삼각형혹다각형,경Fibronectin개도점부배양후형태비교균일,정장사형극륭군.류식세포의검측사선후적황인대간세포CD90、CD73양성솔＞96.8％,CD105양성솔＞95.9％,이stro-1위음성.실험조천소홍염색정강양성,유홍O염색가견대소불등지적정홍색,아리신란염색대량단백취당취집정람색,대조조균위음성.PT-PCR측정실험조성골기인(OC、ALP、RUNX-2)、성지방기인(LPL、APP、PPA R2)、성연골기인(COLⅡ、AGG、SOX9)현저상조,기중RUNX-2재대조조유저수평표체.면역조화현시황인대간세포화골수간충질간세포균표체a-SMA、Ⅰ형효원、섬련단백,단균불표체Ⅱ형효원.량충간세포균초과80％적세포비례처우G0/G1기제시도유흔강자아경신능력(P＞0.05).CCK-8검측불동시간점량충세포적증식능력,재제1～10천시OD치축점증가,제10～14천체은정상태,이자유상사적증식능력(P＞0.05).량충간세포균표체간성기인NONAG、OCT-4、SOX2,조간차이무현저성(P＞0.05).결론:통과Fibronectin차별점부사선법가유효사선순화출황인대간세포,기가향성골、성지、성연골다향분화,위조직공정기술치료퇴변추간반제공료신적충자세포.