CAJ | 학술논문

背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比，将基因通过慢病毒转染入宿主细胞，可以得到长期高效的持续表达，采取双/多基因共修饰治疗的策略，较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。 　　目的：构建 sox9基因慢病毒载体以及 LMP1基因慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察 SOX9和LMP1基因的表达情况。 　　方法：双酶切从 GeneArt 提供的含 sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体，获得含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列，并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer载体，获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP)，以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。 　　结果与结论：测序结果显示质粒 pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致，成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达，RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带 sox9基因的 Lenti-SOX9-GFP 慢病毒载体，以及红色荧光蛋白的携带 LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体，为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。
배경：여전통세포인자유도액유도적방법상비，장기인통과만병독전염입숙주세포，가이득도장기고효적지속표체，채취쌍/다기인공수식치료적책략，교채용단일적인자래유도골수간충질간세포향류수핵세포방향전화가획득경호적효과。 　　목적：구건 sox9기인만병독재체이급 LMP1기인만병독재체，병공전염토골수간충질간세포，관찰 SOX9화LMP1기인적표체정황。 　　방법：쌍매절종 GeneArt 제공적함 sox9기인서렬적질립13ABIV6C_1366933병극륭도pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP재체，획득함sox9기인적질립pLMIG-13GS0345-1。통과단련oligo설계급합성LMP1기인서렬，병극륭도pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer재체，획득함LMP1기인적질립13GS0318-1。재통과293T세포포장후획득록색형광단백표기적sox9기인만병독재체(Lenti-SOX9-GFP)，이급홍색형광단백적LMP1기인만병독재체(Lenti-LMP1-RFP)。장Lenti-SOX9-GFP화Lenti-LMP1-RFP공전염토골수간충질간세포，관찰sox9기인급LMP1기인적표체정황。 　　결과여결론：측서결과현시질립 pLMIG-13GS0345-1화13GS0318-1중적삽입서렬여기인고중sox9(NM_000346)급LMP1(AF345904.1)기인서렬완전일치，성공구건Lenti-SOX9-GFP화Lenti-LMP1-RFP만병독재체。Lenti-SOX9-GFP화Lenti-LMP1-RFP공전염토골수간충질간세포후동일시야하가관찰도록색화홍색형광단백적공표체，RT-PCR여Western Blot검측결과증명Lenti-SOX9-GFP화Lenti-LMP1-RFP가성공고효공전염목적세포병가재mRNA급단백수평동시표체SOX9급LMP1。결과설명실험성공구건료록색형광단백표기적휴대 sox9기인적 Lenti-SOX9-GFP 만병독재체，이급홍색형광단백적휴대 LMP1기인적Lenti-LMP1-RFP만병독재체，위sox9화LMP1기인공수식조직공정수핵적연구제공전기실험기출。