中国癌症防治杂志
中國癌癥防治雜誌
중국암증방치잡지
CHINESE JOURNAL OF ONCOLOGY PREVENTION AND TREATMENT
2014年
4期
342-347
,共6页
子宫颈肿瘤%人端粒酶逆转录酶基因%慢病毒载体%小片段RNA%caski细胞
子宮頸腫瘤%人耑粒酶逆轉錄酶基因%慢病毒載體%小片段RNA%caski細胞
자궁경종류%인단립매역전록매기인%만병독재체%소편단RNA%caski세포
目的 构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)慢病毒(lentivirus,LV)表达载体,并观察其在子宫颈癌caski细胞的表达情况.方法 以Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT基因特异性的小片段RNA(shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/H1/GFP+Pum,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA测序验证hTERT片段准确性.LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞.将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-shNC的caski细胞)和hTERT干扰组(感染携带LV3-shhTERT慢病毒的caski细胞).绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染后基因hTERT mRNA的表达情况,CCK-8法检测caski细胞增殖情况.结果 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞.荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达.hTERT干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较阴性对照组生长缓慢.结论 成功构建了携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染子宫颈癌caski细胞.该载体能够有效抑制hTERT的表达,使子宫颈癌caski细胞增殖缓慢,为进一步探讨hTERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础.
目的 構建及鑒定攜帶沉默人耑粒酶逆轉錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)慢病毒(lentivirus,LV)錶達載體,併觀察其在子宮頸癌caski細胞的錶達情況.方法 以Designer3.0(Genepharma)軟件設計靶嚮hTERT基因特異性的小片段RNA(shRNA)榦擾序列,將hTERT-shRNA基因片段插入重組慢病毒pGLV3/H1/GFP+Pum,構建慢病毒錶達質粒LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA測序驗證hTERT片段準確性.LV3-shRNA-hTERT與包裝質粒共轉染293T細胞,濃縮上清液併測定病毒滴度穫得重組慢病毒後感染caski細胞.將細胞分為空白對照組(未感染病毒的caski細胞)、陰性對照組(感染空載病毒LV3-shNC的caski細胞)和hTERT榦擾組(感染攜帶LV3-shhTERT慢病毒的caski細胞).綠色熒光蛋白(GFP)的錶達判斷轉染結果併估計轉染效率,流式細胞術儀檢測病毒感染率,實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測轉染後基因hTERT mRNA的錶達情況,CCK-8法檢測caski細胞增殖情況.結果 將目的序列成功連接到載體上,併經測序分析證實載體構建成功;成功包裝成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宮頸癌caski細胞.熒光定量PCR檢測結果證實構建的hTERT-小片段榦擾RNA慢病毒錶達載體可顯著抑製hTERT基因的錶達.hTERT榦擾組細胞增殖受抑製,生長速度較陰性對照組生長緩慢.結論 成功構建瞭攜帶hTERT-shRNA慢病毒錶達載體LV3-shRNA-hTERT,併穩定轉染子宮頸癌caski細胞.該載體能夠有效抑製hTERT的錶達,使子宮頸癌caski細胞增殖緩慢,為進一步探討hTERT基因在子宮頸癌的髮病機製和體外基因榦預治療奠定基礎.
목적 구건급감정휴대침묵인단립매역전록매기인(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)만병독(lentivirus,LV)표체재체,병관찰기재자궁경암caski세포적표체정황.방법 이Designer3.0(Genepharma)연건설계파향hTERT기인특이성적소편단RNA(shRNA)간우서렬,장hTERT-shRNA기인편단삽입중조만병독pGLV3/H1/GFP+Pum,구건만병독표체질립LV3-shRNA-hTERT,매절、DNA측서험증hTERT편단준학성.LV3-shRNA-hTERT여포장질립공전염293T세포,농축상청액병측정병독적도획득중조만병독후감염caski세포.장세포분위공백대조조(미감염병독적caski세포)、음성대조조(감염공재병독LV3-shNC적caski세포)화hTERT간우조(감염휴대LV3-shhTERT만병독적caski세포).록색형광단백(GFP)적표체판단전염결과병고계전염효솔,류식세포술의검측병독감염솔,실시형광정량PCR법(qRT-PCR)검측전염후기인hTERT mRNA적표체정황,CCK-8법검측caski세포증식정황.결과 장목적서렬성공련접도재체상,병경측서분석증실재체구건성공;성공포장성고적도적만병독,차능유효감염자궁경암caski세포.형광정량PCR검측결과증실구건적hTERT-소편단간우RNA만병독표체재체가현저억제hTERT기인적표체.hTERT간우조세포증식수억제,생장속도교음성대조조생장완만.결론 성공구건료휴대hTERT-shRNA만병독표체재체LV3-shRNA-hTERT,병은정전염자궁경암caski세포.해재체능구유효억제hTERT적표체,사자궁경암caski세포증식완만,위진일보탐토hTERT기인재자궁경암적발병궤제화체외기인간예치료전정기출.
