中华病理学杂志
中華病理學雜誌
중화병이학잡지
Chinese Journal of Pathology
2015年
4期
274-277
,共4页
张玲%贺婵婷%毕炀辉%刘峰%崔鹤洋%王娟%宋彬%师如意%杨斌%王芳%贾志武%赵振祥%刘静
張玲%賀嬋婷%畢煬輝%劉峰%崔鶴洋%王娟%宋彬%師如意%楊斌%王芳%賈誌武%趙振祥%劉靜
장령%하선정%필양휘%류봉%최학양%왕연%송빈%사여의%양빈%왕방%가지무%조진상%류정
黑色素瘤%转染%印迹法,蛋白质
黑色素瘤%轉染%印跡法,蛋白質
흑색소류%전염%인적법,단백질
Melanoma%Transfection%Blotting,western
目的：研究野生型BRAF及突变型BRAFV600E背景下Mps1激酶对BRAFWT／MEK／ERK通路的影响。方法（1）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中单独或联合转染pBabe－puro－GST－BRAF－WT／pBabe－puro－GST－BRAFV600E、pBabe－puro－GFP－Mps1－WT 及空载体，应用 Western blot方法来检测 Mps1及 p－ERK 表达水平。（2）用 pSUPER－Mps1反转录病毒感染 BRAF 野生型及BRAFV600E突变型背景黑色素瘤细胞，敲低内源性Mps1，Western blot法检测Mps1及p－ERK表达水平。（3）在BRAFV600E突变型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GFP－Mps1，Western blot法检测Mps1及p－ERK表达水平。结果（1）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GST－BRAF－WT及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，与未处理组及转染空载体组相比，p－ERK水平显著降低（ P＜0．01）；在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GST－BRAFV600E及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，与未处理组及转染空载体组相比，p－ERK表达水平未发生明显变化。（2）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中敲低内源性Mps1后，与对照组相比p－ERK含量增多；而在BRAFV600E突变型黑色素瘤细胞中敲低内源性Mps1后，与对照组相比p－ERK含量未发生明显变化。（3）转染Mps1的BRAFV600E突变型细胞中 p－ERK 水平较对照组及空载体组没有发生显著变化。结论Mps1激酶和BRAFWT／MEK／ERK通路之间存在一条自动调节的负反馈回路，而癌基因BRAFV600E表现出对该负反馈回路的抵抗作用。
目的：研究野生型BRAF及突變型BRAFV600E揹景下Mps1激酶對BRAFWT／MEK／ERK通路的影響。方法（1）在BRAF野生型揹景的黑色素瘤細胞中單獨或聯閤轉染pBabe－puro－GST－BRAF－WT／pBabe－puro－GST－BRAFV600E、pBabe－puro－GFP－Mps1－WT 及空載體，應用 Western blot方法來檢測 Mps1及 p－ERK 錶達水平。（2）用 pSUPER－Mps1反轉錄病毒感染 BRAF 野生型及BRAFV600E突變型揹景黑色素瘤細胞，敲低內源性Mps1，Western blot法檢測Mps1及p－ERK錶達水平。（3）在BRAFV600E突變型揹景的黑色素瘤細胞中轉染pBabe－puro－GFP－Mps1，Western blot法檢測Mps1及p－ERK錶達水平。結果（1）在BRAF野生型揹景的黑色素瘤細胞中轉染pBabe－puro－GST－BRAF－WT及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，與未處理組及轉染空載體組相比，p－ERK水平顯著降低（ P＜0．01）；在BRAF野生型揹景的黑色素瘤細胞中轉染pBabe－puro－GST－BRAFV600E及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，與未處理組及轉染空載體組相比，p－ERK錶達水平未髮生明顯變化。（2）在BRAF野生型揹景的黑色素瘤細胞中敲低內源性Mps1後，與對照組相比p－ERK含量增多；而在BRAFV600E突變型黑色素瘤細胞中敲低內源性Mps1後，與對照組相比p－ERK含量未髮生明顯變化。（3）轉染Mps1的BRAFV600E突變型細胞中 p－ERK 水平較對照組及空載體組沒有髮生顯著變化。結論Mps1激酶和BRAFWT／MEK／ERK通路之間存在一條自動調節的負反饋迴路，而癌基因BRAFV600E錶現齣對該負反饋迴路的牴抗作用。
목적：연구야생형BRAF급돌변형BRAFV600E배경하Mps1격매대BRAFWT／MEK／ERK통로적영향。방법（1）재BRAF야생형배경적흑색소류세포중단독혹연합전염pBabe－puro－GST－BRAF－WT／pBabe－puro－GST－BRAFV600E、pBabe－puro－GFP－Mps1－WT 급공재체，응용 Western blot방법래검측 Mps1급 p－ERK 표체수평。（2）용 pSUPER－Mps1반전록병독감염 BRAF 야생형급BRAFV600E돌변형배경흑색소류세포，고저내원성Mps1，Western blot법검측Mps1급p－ERK표체수평。（3）재BRAFV600E돌변형배경적흑색소류세포중전염pBabe－puro－GFP－Mps1，Western blot법검측Mps1급p－ERK표체수평。결과（1）재BRAF야생형배경적흑색소류세포중전염pBabe－puro－GST－BRAF－WT급pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，여미처리조급전염공재체조상비，p－ERK수평현저강저（ P＜0．01）；재BRAF야생형배경적흑색소류세포중전염pBabe－puro－GST－BRAFV600E급pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，여미처리조급전염공재체조상비，p－ERK표체수평미발생명현변화。（2）재BRAF야생형배경적흑색소류세포중고저내원성Mps1후，여대조조상비p－ERK함량증다；이재BRAFV600E돌변형흑색소류세포중고저내원성Mps1후，여대조조상비p－ERK함량미발생명현변화。（3）전염Mps1적BRAFV600E돌변형세포중 p－ERK 수평교대조조급공재체조몰유발생현저변화。결론Mps1격매화BRAFWT／MEK／ERK통로지간존재일조자동조절적부반궤회로，이암기인BRAFV600E표현출대해부반궤회로적저항작용。
Objective To study the effect of Mps1 on BRAFWT/MEK/ERK pathway in the presence of wild type BRAF or BRAFV600E in melanoma.Methods Melanoma cells harboring BRAFWT genotype were transfected either with pBabe-puro-GST-BRAF-WT and/or pBabe-puro-GFP-Mps1-WT or pBabe-puro-GST-BRAFV600E and/or pBabe-puro-GFP-Mps1-WT, followed by Western blot to detect Mps1 and p-ERK expression.The melanoma cells harboring BRAFWT and BRAFV600E genotype were infected with pSUPER-Mps1 retrovirus to knockdown the endogenous Mps1 protein, followed by Western blot to detect Mps1 and p-ERK expression.Meanwhile, melanoma cells harboring BRAFV600E genotype were infected with pBabe-puro-GFP-Mps1 and Western blot was performed to detect Mps1 and p-ERK expression. Results In melanoma cells harboring BRAFWT genotype and transfected with pBabe-puro-GST-BRAF-WT and pBabe-puro-GFP-Mps1-WT, phospho-ERK levels were notably reduced as compared to either negative control or empty vector.However, cells transfected with pBabe-puro-GST-BRAFV600E and pBabe-puro-GFP-Mps1-WT, phospho-ERK levels did not change significantly compared with either negative control or empty vector.Knockout of Mps1 in BRAF wild-type cell lines led to an increased ERK activity.However, there was no significant change of ERK activity in BRAFV600E cell lines in the absence of Mps1.The expression of p-ERK in BRAFV600E mutant cell lines infected with pBabe-puro-GFP-Mps1-WT did not show any significant difference from either negative control or empty vector. Conclusions Based on these findings, it suggests that there exists an auto-regulatory negative feedback loop between the Mps1 kinase and BRAFWT/ERK signaling.Oncogenic BRAFV600E abrogates the regulatory negative feedback loop of Mps1 on the MAPK pathway.
