中国水产科学
中國水產科學
중국수산과학
Journal of Fishery Sciences of China
2015年
2期
214-223
,共10页
臧坤%徐永江%柳学周%史宝%王妍妍
臧坤%徐永江%柳學週%史寶%王妍妍
장곤%서영강%류학주%사보%왕연연
星突江鲽%IGF-Ⅱ%原核表达%生物活性
星突江鰈%IGF-Ⅱ%原覈錶達%生物活性
성돌강접%IGF-Ⅱ%원핵표체%생물활성
Platichthys stellatus%IGF-Ⅱ%prokaryotic expression%bioactivity
根据鲽形目和鲈形目鱼类的IGF-Ⅱ基因保守序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆得到编码星突江鲽(Platichthys stellatus) IGF-Ⅱ成熟肽的全长cDNA序列(210 bp),同源性分析显示IGF-Ⅱ成熟肽在B、A和D区高度保守.利用原核表达载体pET-28a构建了重组表达质粒(IGF-Ⅱ/pET28a),转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导,获得了N端含6个组氨酸的重组蛋白.37℃条件下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的42.7％.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经SDS-PAGE电泳检测,IGF-Ⅱ重组蛋白大小为11.4 kD,Western-Blotting免疫印迹呈阳性.包涵体经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性后,获得了纯化IGF-Ⅱ蛋白.细胞增殖实验结果显示,重组蛋白可显著促进人胚胎肾细胞HEK293T的增殖,表明获得的IGF-Ⅱ重组蛋白具有细胞水平的生物活性.研究结果为深入研究星突江鲽IGF-Ⅱ的功能提供了基础资料.
根據鰈形目和鱸形目魚類的IGF-Ⅱ基因保守序列設計特異性引物,利用RT-PCR技術剋隆得到編碼星突江鰈(Platichthys stellatus) IGF-Ⅱ成熟肽的全長cDNA序列(210 bp),同源性分析顯示IGF-Ⅱ成熟肽在B、A和D區高度保守.利用原覈錶達載體pET-28a構建瞭重組錶達質粒(IGF-Ⅱ/pET28a),轉化大腸桿菌BL21(DE3)後經IPTG誘導,穫得瞭N耑含6箇組氨痠的重組蛋白.37℃條件下用1.0 mmol/L的IPTG誘導6h,目的蛋白錶達量最高,佔菌體總蛋白的42.7％.重組蛋白主要以包涵體形式存在,經SDS-PAGE電泳檢測,IGF-Ⅱ重組蛋白大小為11.4 kD,Western-Blotting免疫印跡呈暘性.包涵體經6 mol/L鹽痠胍變性、Ni2+離子親和柱純化和尿素梯度複性後,穫得瞭純化IGF-Ⅱ蛋白.細胞增殖實驗結果顯示,重組蛋白可顯著促進人胚胎腎細胞HEK293T的增殖,錶明穫得的IGF-Ⅱ重組蛋白具有細胞水平的生物活性.研究結果為深入研究星突江鰈IGF-Ⅱ的功能提供瞭基礎資料.
근거접형목화로형목어류적IGF-Ⅱ기인보수서렬설계특이성인물,이용RT-PCR기술극륭득도편마성돌강접(Platichthys stellatus) IGF-Ⅱ성숙태적전장cDNA서렬(210 bp),동원성분석현시IGF-Ⅱ성숙태재B、A화D구고도보수.이용원핵표체재체pET-28a구건료중조표체질립(IGF-Ⅱ/pET28a),전화대장간균BL21(DE3)후경IPTG유도,획득료N단함6개조안산적중조단백.37℃조건하용1.0 mmol/L적IPTG유도6h,목적단백표체량최고,점균체총단백적42.7％.중조단백주요이포함체형식존재,경SDS-PAGE전영검측,IGF-Ⅱ중조단백대소위11.4 kD,Western-Blotting면역인적정양성.포함체경6 mol/L염산고변성、Ni2+리자친화주순화화뇨소제도복성후,획득료순화IGF-Ⅱ단백.세포증식실험결과현시,중조단백가현저촉진인배태신세포HEK293T적증식,표명획득적IGF-Ⅱ중조단백구유세포수평적생물활성.연구결과위심입연구성돌강접IGF-Ⅱ적공능제공료기출자료.
