中华眼科医学杂志（电子版）
中華眼科醫學雜誌（電子版）
중화안과의학잡지（전자판）
CHINESE JOURNAL OF OPHTHALMOLOGIC MEDICINE(ELECTRONIC EDITION)
2015年
2期
63-67
,共5页
视网膜干细胞%体外诱导%视网膜神经节细胞%胎牛血清
視網膜榦細胞%體外誘導%視網膜神經節細胞%胎牛血清
시망막간세포%체외유도%시망막신경절세포%태우혈청
Retinal stem cells%In-vitro induction%Retinal ganglion cells%FBS medium
目的：探讨胎牛血清（ FBS）传代培养诱导新生大鼠视网膜干细胞向视网膜神经节细胞（ RGCs）分化的可能性，为视网膜细胞体外诱导研究提供新思路和新方法。方法本研究采用新生5d的大鼠作为实验动物，来源于北京维通利华实验动物技术公司。采用贴壁培养法分离小鼠视网膜细胞的胰蛋白酶，在10％FBS的DMEM／F12培养基中传代培养，经过连续传代纯化细胞。通过免疫荧光法和逆转录-聚合酶链式反应（ RT-PCR）鉴定诱导细胞的分化情况。结果大鼠视网膜混合细胞原代培养24 h后，可见部分细胞开始贴壁、伸展，但仍有大量细胞悬浮。48 h换液时，可见大量细胞呈短梭形，分散贴壁生长。4 d后可见细胞呈集落样生长，具有典型的RSCs形态；7～10 d后细胞融合成片，可传代。传代后12 h内细胞贴壁，多呈长扁形，双极性，末端呈分枝状。传至第3代时，细胞生长最旺盛；传至第5代时，细胞生长减缓，形态趋于一致。免疫荧光鉴定表达蛋白的结果：（1）原代混合细胞：表达光感受器标志物及干细胞标志物Nestin，节细胞标志物Thy-1，视紫红质及Muller胶质细胞标志物谷氨酰氨合成酶。从荧光强度和数量可以看出，与本身细胞核染色密度相比，光感受细胞、节细胞和Muller胶质细胞的数量并不多，且存在大量表达阳性Nestin的RSCs；（2）高血清培养体系纯化的第5代细胞：细胞形态未发生改变，表达视网膜神经节细胞的标志物Thy-1、Nogo-R及Tuj1，均呈强阳性。 RNA的含量为0．287μg／ml，RNA纯度为1．66。电泳结果：（1）第1代F1细胞PCR的结果：RPCs的标志物Nestin及Masushi为阳性，证明存在一定数量的RSCs。而成熟节细胞的标志物Thy-1为弱阳性，证明成熟RGCs细胞的含量不高。阳性对照的Actin为强阳性。（2）第5代F5细胞PCR的结果：RPCs的标志物Nestin及Masushi为弱阳性，证明残留的RSCs数量较低。而成熟节细胞的标志物Thy-1为强阳性，证明产生了大量的类节细胞。阳性对照的Actin为强阳性。大鼠视网膜混合细胞存在发育成熟的光感受器细胞、神经节细胞及胶质细胞，但细胞数量并不多，且存在一定数量的RSCs。经高血清贴壁诱导后，RSCs可分化为大量具有RGCs标志物的细胞。结论在体外分离的SD大鼠视网膜混合细胞中存在RSCs。通过FBS体系的传代诱导，可得到具有RGCs表型的细胞。
目的：探討胎牛血清（ FBS）傳代培養誘導新生大鼠視網膜榦細胞嚮視網膜神經節細胞（ RGCs）分化的可能性，為視網膜細胞體外誘導研究提供新思路和新方法。方法本研究採用新生5d的大鼠作為實驗動物，來源于北京維通利華實驗動物技術公司。採用貼壁培養法分離小鼠視網膜細胞的胰蛋白酶，在10％FBS的DMEM／F12培養基中傳代培養，經過連續傳代純化細胞。通過免疫熒光法和逆轉錄-聚閤酶鏈式反應（ RT-PCR）鑒定誘導細胞的分化情況。結果大鼠視網膜混閤細胞原代培養24 h後，可見部分細胞開始貼壁、伸展，但仍有大量細胞懸浮。48 h換液時，可見大量細胞呈短梭形，分散貼壁生長。4 d後可見細胞呈集落樣生長，具有典型的RSCs形態；7～10 d後細胞融閤成片，可傳代。傳代後12 h內細胞貼壁，多呈長扁形，雙極性，末耑呈分枝狀。傳至第3代時，細胞生長最旺盛；傳至第5代時，細胞生長減緩，形態趨于一緻。免疫熒光鑒定錶達蛋白的結果：（1）原代混閤細胞：錶達光感受器標誌物及榦細胞標誌物Nestin，節細胞標誌物Thy-1，視紫紅質及Muller膠質細胞標誌物穀氨酰氨閤成酶。從熒光彊度和數量可以看齣，與本身細胞覈染色密度相比，光感受細胞、節細胞和Muller膠質細胞的數量併不多，且存在大量錶達暘性Nestin的RSCs；（2）高血清培養體繫純化的第5代細胞：細胞形態未髮生改變，錶達視網膜神經節細胞的標誌物Thy-1、Nogo-R及Tuj1，均呈彊暘性。 RNA的含量為0．287μg／ml，RNA純度為1．66。電泳結果：（1）第1代F1細胞PCR的結果：RPCs的標誌物Nestin及Masushi為暘性，證明存在一定數量的RSCs。而成熟節細胞的標誌物Thy-1為弱暘性，證明成熟RGCs細胞的含量不高。暘性對照的Actin為彊暘性。（2）第5代F5細胞PCR的結果：RPCs的標誌物Nestin及Masushi為弱暘性，證明殘留的RSCs數量較低。而成熟節細胞的標誌物Thy-1為彊暘性，證明產生瞭大量的類節細胞。暘性對照的Actin為彊暘性。大鼠視網膜混閤細胞存在髮育成熟的光感受器細胞、神經節細胞及膠質細胞，但細胞數量併不多，且存在一定數量的RSCs。經高血清貼壁誘導後，RSCs可分化為大量具有RGCs標誌物的細胞。結論在體外分離的SD大鼠視網膜混閤細胞中存在RSCs。通過FBS體繫的傳代誘導，可得到具有RGCs錶型的細胞。
목적：탐토태우혈청（ FBS）전대배양유도신생대서시망막간세포향시망막신경절세포（ RGCs）분화적가능성，위시망막세포체외유도연구제공신사로화신방법。방법본연구채용신생5d적대서작위실험동물，래원우북경유통리화실험동물기술공사。채용첩벽배양법분리소서시망막세포적이단백매，재10％FBS적DMEM／F12배양기중전대배양，경과련속전대순화세포。통과면역형광법화역전록-취합매련식반응（ RT-PCR）감정유도세포적분화정황。결과대서시망막혼합세포원대배양24 h후，가견부분세포개시첩벽、신전，단잉유대량세포현부。48 h환액시，가견대량세포정단사형，분산첩벽생장。4 d후가견세포정집락양생장，구유전형적RSCs형태；7～10 d후세포융합성편，가전대。전대후12 h내세포첩벽，다정장편형，쌍겁성，말단정분지상。전지제3대시，세포생장최왕성；전지제5대시，세포생장감완，형태추우일치。면역형광감정표체단백적결과：（1）원대혼합세포：표체광감수기표지물급간세포표지물Nestin，절세포표지물Thy-1，시자홍질급Muller효질세포표지물곡안선안합성매。종형광강도화수량가이간출，여본신세포핵염색밀도상비，광감수세포、절세포화Muller효질세포적수량병불다，차존재대량표체양성Nestin적RSCs；（2）고혈청배양체계순화적제5대세포：세포형태미발생개변，표체시망막신경절세포적표지물Thy-1、Nogo-R급Tuj1，균정강양성。 RNA적함량위0．287μg／ml，RNA순도위1．66。전영결과：（1）제1대F1세포PCR적결과：RPCs적표지물Nestin급Masushi위양성，증명존재일정수량적RSCs。이성숙절세포적표지물Thy-1위약양성，증명성숙RGCs세포적함량불고。양성대조적Actin위강양성。（2）제5대F5세포PCR적결과：RPCs적표지물Nestin급Masushi위약양성，증명잔류적RSCs수량교저。이성숙절세포적표지물Thy-1위강양성，증명산생료대량적류절세포。양성대조적Actin위강양성。대서시망막혼합세포존재발육성숙적광감수기세포、신경절세포급효질세포，단세포수량병불다，차존재일정수량적RSCs。경고혈청첩벽유도후，RSCs가분화위대량구유RGCs표지물적세포。결론재체외분리적SD대서시망막혼합세포중존재RSCs。통과FBS체계적전대유도，가득도구유RGCs표형적세포。
Objective To investigate the ability of 10%fetal bovine serum ( FBS) to induce the differentiation of retinal stem cells ( RSCs ) derived from new born rats into retinal ganglion-like cells in vitro.Method Mixed retinal cells were isolated from post-natal day 5 rats and cultured to passage 5 in flasks in DMEM/F12 medium supplemented with 10%FBS.Protein and mRNA levels of markers specific for RSCs (Nestin and Masushi) and retinal ganglion cells (Thy-1) in both freshly isolated mixed retinal cells and cultured cells at passage 5 were determined by immunofluorescence and RT-PCR respectively. Result After the initial culture for 24 h, a small proportion of mixed retinal cells became adherent and elongated while the majority of the cells remained unattached.At the time of the first medium change at 48 h, cells displayed a short spindle-shaped morphology with a scattered pattern of growth.At 4 days,cells displayed a typical morphology of RSCs and became colonized.At days 7-10,cells grew to a confluentmonolayer and were sub-cultured.At 12 h after sub-culture,cells became bipolarized and had a long spindleshapedmorphology with emerging branches at the end of the spindle.At passage 3, cells underwentexponential growth.By passage 5,the morphology of the cells became uniform and cell growth was sloweddown.High protein and mRNA levels of stem cell markers Nestin and Masuhi but low protein and mRNAlevels of ganglion cell mark Thy-1 were detected in freshly isolated mixed cells.In contrast,Nestin andMasuhi protein and mRNA levels were significantly increased but Thy-1 protein and mRNA levels weresignificantly reduced in passage 5 cells as compared with the initial cell preparations ( P <0.05). Conclusion There remain RSCs in PN5 Stem cells are present in post-natal rat retina cells.Continuouspassaging in medium containing 10% FBS may induce differentiation of these stem cells into retinal ganglioncells in vitro.
