CAJ | 학술논문

【目的】建立一个可同时检测豇豆花叶病毒属（Comovirus）和蚕豆病毒属（Fabavirus）病毒的通用RT-PCR 检测方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在其保守区域设计简并引物，用于这2个病毒属病毒的通用RT-PCR检测，并进行灵敏性、特异性试验。为便于PCR产物直接测序，在简并引物中引入通用测序引物（RV-M和M13-47），并通过序列分析对病毒种类鉴定。利用该方法对来自福建柘荣的太子参病毒进行检测验证。【结果】设计一对简并引物，建立了一个用于扩增豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒部分依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的通用RT-PCR方法。该方法成功用于检测安第斯马铃薯斑驳病毒（ApMoV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、蚕豆真花叶病毒（BBTMV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）和萝卜花叶病毒（RaMV）9种豇豆花叶病毒属病毒；蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）、蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2）2种蚕豆病毒属病毒共计17个分离物，而不能与同亚科的线虫传多面体病毒属病毒及健康寄主植物反应，显示出良好的广谱性和特异性。在简并引物的5′端分别加入一段非互补的通用测序引物序列（RV-M和M13-47），不仅可以利用该通用测序引物进行PCR产物直接测序，而且检测灵敏度可以提高10—100倍。序列及系统发育分析表明，所扩增的序列可以把豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒区分到种的水平。利用该方法测定了BBSV的部分RdRp基因序列，显示出与RCMV具有最近的亲缘关系。利用该方法在太子参中检出 BBWV2。【结论】建立的通用 RT-PCR 方法可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的广谱性检测，结合序列可进行病毒种类的快速鉴定，并且可能用于新病毒种类的检测鉴定。【目的】建立一箇可同時檢測豇豆花葉病毒屬（Comovirus）和蠶豆病毒屬（Fabavirus）病毒的通用RT-PCR 檢測方法。【方法】通過基因組序列的多重比對分析，在其保守區域設計簡併引物，用于這2箇病毒屬病毒的通用RT-PCR檢測，併進行靈敏性、特異性試驗。為便于PCR產物直接測序，在簡併引物中引入通用測序引物（RV-M和M13-47），併通過序列分析對病毒種類鑒定。利用該方法對來自福建柘榮的太子參病毒進行檢測驗證。【結果】設計一對簡併引物，建立瞭一箇用于擴增豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒部分依賴于RNA的RNA聚閤酶（RdRp）基因的通用RT-PCR方法。該方法成功用于檢測安第斯馬鈴藷斑駁病毒（ApMoV）、蠶豆染色病毒（BBSV）、蠶豆真花葉病毒（BBTMV）、菜豆莢斑駁病毒（BPMV）、豇豆花葉病毒（CPMV）、豇豆重花葉病毒（CPSMV）、南瓜花葉病毒（SqMV）、紅三葉草斑駁病毒（RCMV）和蘿蔔花葉病毒（RaMV）9種豇豆花葉病毒屬病毒；蠶豆萎蔫病毒1號（BBWV1）、蠶豆萎蔫病毒2號（BBWV2）2種蠶豆病毒屬病毒共計17箇分離物，而不能與同亞科的線蟲傳多麵體病毒屬病毒及健康寄主植物反應，顯示齣良好的廣譜性和特異性。在簡併引物的5′耑分彆加入一段非互補的通用測序引物序列（RV-M和M13-47），不僅可以利用該通用測序引物進行PCR產物直接測序，而且檢測靈敏度可以提高10—100倍。序列及繫統髮育分析錶明，所擴增的序列可以把豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒區分到種的水平。利用該方法測定瞭BBSV的部分RdRp基因序列，顯示齣與RCMV具有最近的親緣關繫。利用該方法在太子參中檢齣 BBWV2。【結論】建立的通用 RT-PCR 方法可用于豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒的廣譜性檢測，結閤序列可進行病毒種類的快速鑒定，併且可能用于新病毒種類的檢測鑒定。
【목적】건립일개가동시검측강두화협병독속（Comovirus）화잠두병독속（Fabavirus）병독적통용RT-PCR 검측방법。【방법】통과기인조서렬적다중비대분석，재기보수구역설계간병인물，용우저2개병독속병독적통용RT-PCR검측，병진행령민성、특이성시험。위편우PCR산물직접측서，재간병인물중인입통용측서인물（RV-M화M13-47），병통과서렬분석대병독충류감정。이용해방법대래자복건자영적태자삼병독진행검측험증。【결과】설계일대간병인물，건립료일개용우확증강두화협병독속화잠두병독속병독부분의뢰우RNA적RNA취합매（RdRp）기인적통용RT-PCR방법。해방법성공용우검측안제사마령서반박병독（ApMoV）、잠두염색병독（BBSV）、잠두진화협병독（BBTMV）、채두협반박병독（BPMV）、강두화협병독（CPMV）、강두중화협병독（CPSMV）、남과화협병독（SqMV）、홍삼협초반박병독（RCMV）화라복화협병독（RaMV）9충강두화협병독속병독；잠두위언병독1호（BBWV1）、잠두위언병독2호（BBWV2）2충잠두병독속병독공계17개분리물，이불능여동아과적선충전다면체병독속병독급건강기주식물반응，현시출량호적엄보성화특이성。재간병인물적5′단분별가입일단비호보적통용측서인물서렬（RV-M화M13-47），불부가이이용해통용측서인물진행PCR산물직접측서，이차검측령민도가이제고10—100배。서렬급계통발육분석표명，소확증적서렬가이파강두화협병독속화잠두병독속병독구분도충적수평。이용해방법측정료BBSV적부분RdRp기인서렬，현시출여RCMV구유최근적친연관계。이용해방법재태자삼중검출 BBWV2。【결론】건립적통용 RT-PCR 방법가용우강두화협병독속화잠두병독속병독적엄보성검측，결합서렬가진행병독충류적쾌속감정，병차가능용우신병독충류적검측감정。
[Objective] The objective of the study is to develop a universal RT-PCR method for the simultaneous detection of the viruses from Comovirus and Fabavirus.[Method]Analysis of the complete nucleotide sequence of comoviruses and fabaviruses was used to design a pair of degenerate primers for specific detection of members of the two genera. The sensitivity and specificity were evaluated, respectively. In order to direct the sequence, the non-complementary universal sequencing primer sequence RV-M and M13-47 were added, respectively, to the 5′termini of the primers. Amplicons were directly sequenced to verify their identity. Finally, the method was used to detect viruses in Pseudostellaria heterophylla coming from Zherong, Fujian Province. [Result]A generic PCR protocols was developed to detect the two virus genera in Comovirus and Fabavirus using degenerate primers designed to amplify part of the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) gene. An expected size product about 350 bp was amplified using the optimized PCR protocols from all 17 isolates of the 9 comovirus species and 2 fabavirus species tested including Andean potato mottle virus (APMoV), Broad bean stain virus (BBSV), Broad bean true mosaic virus (BBTMV), Bean pod mottle virus (BPMV), Cowpea mosaic virus (CPMV), Cowpea severe mosaic virus (CPSMV), Radish mosaic virus (RaMV), Red clover mottle virus (RCMV), Squash mosaic virus (SqMV), Broad bean wilt virus 1 (BBWV1) and Broad bean wilt virus 2 (BBWV2). When the RV-M and M13-47 primer sequences were added, respectively, to the 5′termini of the primers, it was not only observed that the PCR’s amplicons could be directly sequenced by the universal sequencing primer, but also it could improve the detection sensitivity by 10-100 times. No cross-reaction was observed with either healthy plants or from isolates in the genus Nepovirus of the Comovirinae. Phylogenetic analysis using the generic PCR’s amplicons sequence showed that it could differentiate comoviruses and fabaviruses at the species level. The partial sequence of the RdRp gene of BBSV was firstly determined by this method, and was shown to have the closest relationship with RCMV. Using this method, BBWV2 was detected in P. heterophylla.[Conclusion]The described generic assay could be applied for the broad spectrum detection of members of the genus Comovirus and Fabavirus and, in combination with the PCR’s amplicons sequence, for the identification of species in the two genera. The assay may also be useful for the detection of new or uncharacterized species within the two genera.