生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2015年
2期
178-181
,共4页
葛晓幸%钟辉%杨晓莉
葛曉倖%鐘輝%楊曉莉
갈효행%종휘%양효리
高尔基体膜蛋白73%糖基化位点突变%肝癌%NF-κB
高爾基體膜蛋白73%糖基化位點突變%肝癌%NF-κB
고이기체막단백73%당기화위점돌변%간암%NF-κB
Golgi membrane protein 73%glycosylation mutation%live cancer%NF-κB
目的：通过构建高尔基体膜蛋白73（GP73）氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒，研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法：根据GP73的DNA序列，设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物，以本实验室构建的野生型质粒pcDNA3-Flag-GP73为模板，构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）；用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞，用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况，用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对HepG2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果：糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白，且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失；双萤光素酶报告基因实验结果表明，野生型GP73能够激活HepG2细胞中NF-κB的转录活性，而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论：构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路，糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。
目的：通過構建高爾基體膜蛋白73（GP73）氨基痠序列109、144位糖基化位點雙突變真覈錶達質粒，研究GP73及其糖基化脩飾對肝癌細胞炎癥相關分子信號通路的影響。方法：根據GP73的DNA序列，設計閤成2對針對GP73氨基痠序列109、144位糖基化位點突變的PCR引物，以本實驗室構建的野生型質粒pcDNA3-Flag-GP73為模闆，構建GP73的109、144位糖基化位點雙突變質粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）；用脂質體將此雙突變質粒轉染293T細胞，用糖蛋白染色和免疫印跡檢測該質粒在細胞中的錶達情況，用雙螢光素酶報告基因實驗檢測GP73及其糖基化脩飾對HepG2細胞中NF-κB轉錄激活的影響。結果：糖蛋白染色和免疫印跡結果證實構建的雙突變質粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）能夠錶達GP73雙糖基化位點突變的蛋白，且糖基化位點的突變使GP73的糖基化脩飾完全缺失；雙螢光素酶報告基因實驗結果錶明，野生型GP73能夠激活HepG2細胞中NF-κB的轉錄活性，而雙糖基化位點突變會使GP73失去此激活作用。結論：構建瞭GP73雙糖基化位點突變的真覈錶達質粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）。GP73參與激活肝癌細胞炎癥信號通路，糖基化脩飾對于GP73髮揮此作用是必不可少的。
목적：통과구건고이기체막단백73（GP73）안기산서렬109、144위당기화위점쌍돌변진핵표체질립，연구GP73급기당기화수식대간암세포염증상관분자신호통로적영향。방법：근거GP73적DNA서렬，설계합성2대침대GP73안기산서렬109、144위당기화위점돌변적PCR인물，이본실험실구건적야생형질립pcDNA3-Flag-GP73위모판，구건GP73적109、144위당기화위점쌍돌변질립pcDNA3-Flag-GP73（DM）；용지질체장차쌍돌변질립전염293T세포，용당단백염색화면역인적검측해질립재세포중적표체정황，용쌍형광소매보고기인실험검측GP73급기당기화수식대HepG2세포중NF-κB전록격활적영향。결과：당단백염색화면역인적결과증실구건적쌍돌변질립pcDNA3-Flag-GP73（DM）능구표체GP73쌍당기화위점돌변적단백，차당기화위점적돌변사GP73적당기화수식완전결실；쌍형광소매보고기인실험결과표명，야생형GP73능구격활HepG2세포중NF-κB적전록활성，이쌍당기화위점돌변회사GP73실거차격활작용。결론：구건료GP73쌍당기화위점돌변적진핵표체질립pcDNA3-Flag-GP73（DM）。GP73삼여격활간암세포염증신호통로，당기화수식대우GP73발휘차작용시필불가소적。
Objective: To study the effect of Golgi membrane protein 73(GP73) and its glycosylation modification on inflammation-related molecular signaling pathways in HepG2 cells. Methods: The eukaryotic expression vector of GP73 without glycosylation modification was constructed and named pcDNA3-Flag-GP73(DM). The mutant plas?mid was transfected into HEK293T cells to test its expression and glycosylation modification by Western blot and glycoprotein staining. The wild type plasmid and mutant plasmid were alternatively transfected into HepG2 cells to test their effect on NF-κB transcription activation by dual-luciferase reporter assay. Results: The plasmid pcD?NA3-Flag-GP73(DM) was constructed successfully. Wild type GP73 may activate NF-κB in HepG2 cells, when mutant GP73 without glycosylation modification lost the function. Conclusion: GP73 may activate inflammation-re?lated molecular signaling pathways in HepG2 cells and its glycosylation modification is essential for the function.
