江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2015年
1期
117-121
,共5页
徐海%鲍熹%王义伟%卢宇%许梦薇%侯继波
徐海%鮑熹%王義偉%盧宇%許夢薇%侯繼波
서해%포희%왕의위%로우%허몽미%후계파
同源重组%DNA疫苗%真核表达%T7噬菌体
同源重組%DNA疫苗%真覈錶達%T7噬菌體
동원중조%DNA역묘%진핵표체%T7서균체
homologous recombination%DNA vaccine%eukaryotic expression%T7 phage
为了构建转运真核表达盒的重组T7噬菌体,并分别在体外、体内条件下检测其标签蛋白质EGFP的表达.以T7噬菌体基因组左侧578 bp处为插入位点,取上游400 bp和下游200 bp片段作为左右同源臂,并在其中插入表达EGFP基因的真核表达盒(EEB),构建同源重组质粒pUC-L-EEB-R.将该质粒载体转化T7噬菌体宿主细菌BL21,在噬菌体繁殖过程中完成同源重组,PCR筛选重组T7-EEB噬菌体.提取该重组噬菌体基因组转染Vero细胞后体外检测EGFP蛋白质表达,纯化的噬菌体免疫小鼠后体内检测EGFP蛋白质表达.结果显示,通过同源重组方法成功构建了携带真核表达盒的重组T7噬菌体,PCR检测和酶切鉴定均证明表达盒已正确插入.T7-EEB基因组转染真核细胞可见明显的EGFP蛋白质表达,免疫小鼠后活体荧光检测到EGFP蛋白质信号,在小鼠肝脏、脾脏组织中RT-PCR检测到EGFP基因的mRNA转录.表明同源重组方法可以用于构建重组T7噬菌体,噬菌体能够转运真核表达盒并实现蛋白质表达.
為瞭構建轉運真覈錶達盒的重組T7噬菌體,併分彆在體外、體內條件下檢測其標籤蛋白質EGFP的錶達.以T7噬菌體基因組左側578 bp處為插入位點,取上遊400 bp和下遊200 bp片段作為左右同源臂,併在其中插入錶達EGFP基因的真覈錶達盒(EEB),構建同源重組質粒pUC-L-EEB-R.將該質粒載體轉化T7噬菌體宿主細菌BL21,在噬菌體繁殖過程中完成同源重組,PCR篩選重組T7-EEB噬菌體.提取該重組噬菌體基因組轉染Vero細胞後體外檢測EGFP蛋白質錶達,純化的噬菌體免疫小鼠後體內檢測EGFP蛋白質錶達.結果顯示,通過同源重組方法成功構建瞭攜帶真覈錶達盒的重組T7噬菌體,PCR檢測和酶切鑒定均證明錶達盒已正確插入.T7-EEB基因組轉染真覈細胞可見明顯的EGFP蛋白質錶達,免疫小鼠後活體熒光檢測到EGFP蛋白質信號,在小鼠肝髒、脾髒組織中RT-PCR檢測到EGFP基因的mRNA轉錄.錶明同源重組方法可以用于構建重組T7噬菌體,噬菌體能夠轉運真覈錶達盒併實現蛋白質錶達.
위료구건전운진핵표체합적중조T7서균체,병분별재체외、체내조건하검측기표첨단백질EGFP적표체.이T7서균체기인조좌측578 bp처위삽입위점,취상유400 bp화하유200 bp편단작위좌우동원비,병재기중삽입표체EGFP기인적진핵표체합(EEB),구건동원중조질립pUC-L-EEB-R.장해질립재체전화T7서균체숙주세균BL21,재서균체번식과정중완성동원중조,PCR사선중조T7-EEB서균체.제취해중조서균체기인조전염Vero세포후체외검측EGFP단백질표체,순화적서균체면역소서후체내검측EGFP단백질표체.결과현시,통과동원중조방법성공구건료휴대진핵표체합적중조T7서균체,PCR검측화매절감정균증명표체합이정학삽입.T7-EEB기인조전염진핵세포가견명현적EGFP단백질표체,면역소서후활체형광검측도EGFP단백질신호,재소서간장、비장조직중RT-PCR검측도EGFP기인적mRNA전록.표명동원중조방법가이용우구건중조T7서균체,서균체능구전운진핵표체합병실현단백질표체.
