CAJ | 학술논문

[目的]为提高苦参碱的杀虫效果,对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶1基因(BxACE1)进行研究.[方法]松材线虫采集自广东省内马尾松,贝曼漏斗法分离,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫.克隆BxACE1基因全长并进行序列分析,通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断该基因功能,研究苦参碱的杀虫效果,并应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果.[结果]5′和3′序列拼接得到基因全长2 145 bp,命名为BxACE1.同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致.蛋白质三维结构分析表明,BxACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠,鉴于氢键数量越多结合越稳定,利用docking技术筛选出石杉碱甲是松材线虫乙酰胆碱酯酶1蛋白的较佳抑制剂.RNAi明显增加了苦参碱的杀虫效果,石杉碱甲本身对线虫毒性较小,共同施用RNAi和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小,但RNAi处理组线虫与Inhibitor(0.03％苦参碱+1μmol· L-1石杉碱甲处理线虫)处理组线虫在24,48及72h存活率差异不显著,表明石杉碱甲处理线虫和BxA CE1基因RNAi处理效果相近.[结论与其他]通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断BxACE1功能均可以提高苦参碱的杀虫效果,RNAi技术能够简单易行地证明若阻断BxACE1功能可以提苦参碱的杀虫效果,但dsRNA容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用.石杉碱甲可以与BxACE1稳定结合,鉴定表明石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果,具有生防药剂辅剂的开发潜力,可替代基因沉默技术实现抑制BxACE1的目的.因此,通过乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲可阻断BxACE1的功能,进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的目的.ACEIs通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性,使线虫体内的胆碱水平短时间内大量提高,从而导致其中毒死亡.该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物,大多为非可逆型ACEIs.石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱,是一种高效、高选择性、可逆性的ACEIs.本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究,是对该植物源药剂的一个新尝试. [目的]為提高苦參堿的殺蟲效果,對鬆材線蟲的藥劑防治靶標乙酰膽堿酯酶1基因(BxACE1)進行研究.[方法]鬆材線蟲採集自廣東省內馬尾鬆,貝曼漏鬥法分離,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培養擴繁線蟲.剋隆BxACE1基因全長併進行序列分析,通過基因沉默和蛋白抑製2種技術阻斷該基因功能,研究苦參堿的殺蟲效果,併應用Q-PCR技術鑒定RNAi效果.[結果]5′和3′序列拼接得到基因全長2 145 bp,命名為BxACE1.同源序列多序列比對錶明線蟲ACE的進化速度與線蟲進化速度一緻.蛋白質三維結構分析錶明,BxACE1由14箇α螺鏇包圍著13箇β摺疊,鑒于氫鍵數量越多結閤越穩定,利用docking技術篩選齣石杉堿甲是鬆材線蟲乙酰膽堿酯酶1蛋白的較佳抑製劑.RNAi明顯增加瞭苦參堿的殺蟲效果,石杉堿甲本身對線蟲毒性較小,共同施用RNAi和石杉堿甲對線蟲毒性仍然較小,但RNAi處理組線蟲與Inhibitor(0.03％苦參堿+1μmol· L-1石杉堿甲處理線蟲)處理組線蟲在24,48及72h存活率差異不顯著,錶明石杉堿甲處理線蟲和BxA CE1基因RNAi處理效果相近.[結論與其他]通過基因沉默和蛋白抑製2種技術阻斷BxACE1功能均可以提高苦參堿的殺蟲效果,RNAi技術能夠簡單易行地證明若阻斷BxACE1功能可以提苦參堿的殺蟲效果,但dsRNA容易降解等因素限製瞭該技術在生產實踐中的廣汎應用.石杉堿甲可以與BxACE1穩定結閤,鑒定錶明石杉堿甲可以提高苦參堿的殺蟲效果,具有生防藥劑輔劑的開髮潛力,可替代基因沉默技術實現抑製BxACE1的目的.因此,通過乙酰膽堿酯酶抑製劑石杉堿甲可阻斷BxACE1的功能,進而達到提高苦參堿等植物源藥劑殺蟲效果的目的.ACEIs通過抑製線蟲體內的乙酰膽堿酯酶的活性,使線蟲體內的膽堿水平短時間內大量提高,從而導緻其中毒死亡.該類具有代錶性的殺蟲劑是有機燐類化閤物和氨基甲痠酯類化閤物,大多為非可逆型ACEIs.石杉堿甲是來源于石杉科植物蛇足石杉的一種半萜生物堿,是一種高效、高選擇性、可逆性的ACEIs.本研究將石杉堿甲引入鬆材線蟲研究,是對該植物源藥劑的一箇新嘗試.
[목적]위제고고삼감적살충효과,대송재선충적약제방치파표을선담감지매1기인(BxACE1)진행연구.[방법]송재선충채집자광동성내마미송,패만루두법분리,회포도포균태상25℃피광배양확번선충.극륭BxACE1기인전장병진행서렬분석,통과기인침묵화단백억제2충기술조단해기인공능,연구고삼감적살충효과,병응용Q-PCR기술감정RNAi효과.[결과]5′화3′서렬병접득도기인전장2 145 bp,명명위BxACE1.동원서렬다서렬비대표명선충ACE적진화속도여선충진화속도일치.단백질삼유결구분석표명,BxACE1유14개α라선포위착13개β절첩,감우경건수량월다결합월은정,이용docking기술사선출석삼감갑시송재선충을선담감지매1단백적교가억제제.RNAi명현증가료고삼감적살충효과,석삼감갑본신대선충독성교소,공동시용RNAi화석삼감갑대선충독성잉연교소,단RNAi처리조선충여Inhibitor(0.03％고삼감+1μmol· L-1석삼감갑처리선충)처리조선충재24,48급72h존활솔차이불현저,표명석삼감갑처리선충화BxA CE1기인RNAi처리효과상근.[결론여기타]통과기인침묵화단백억제2충기술조단BxACE1공능균가이제고고삼감적살충효과,RNAi기술능구간단역행지증명약조단BxACE1공능가이제고삼감적살충효과,단dsRNA용역강해등인소한제료해기술재생산실천중적엄범응용.석삼감갑가이여BxACE1은정결합,감정표명석삼감갑가이제고고삼감적살충효과,구유생방약제보제적개발잠력,가체대기인침묵기술실현억제BxACE1적목적.인차,통과을선담감지매억제제석삼감갑가조단BxACE1적공능,진이체도제고고삼감등식물원약제살충효과적목적.ACEIs통과억제선충체내적을선담감지매적활성,사선충체내적담감수평단시간내대량제고,종이도치기중독사망.해류구유대표성적살충제시유궤린류화합물화안기갑산지류화합물,대다위비가역형ACEIs.석삼감갑시래원우석삼과식물사족석삼적일충반첩생물감,시일충고효、고선택성、가역성적ACEIs.본연구장석삼감갑인입송재선충연구,시대해식물원약제적일개신상시.