CAJ | 학술논문

AM79 aroA (WO/2009/059485)基因是从草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我国自主知识产权的新型草甘膦抗性基因,具有重要应用价值.为进一步解析AM79 EPSPS蛋白的作用机制,本研究对此蛋白的活性位点进行了研究.进化树分析显示AM79 EPSPS属于Ⅰ型EPSPS.序列比对结果表明AM79 EPSPS中第107位的丙氨酸(Ala),第114位的苯丙氨酸(Phe),第355位的Ala和第356位的组氨酸(His)是特异的.采用重叠延伸PCR介导的核苷酸定点突变技术,对这些保守的氨基酸位点进行定点突变.将AM79 aroA及其突变基因转入大肠杆菌(Escherichia coli)aroA缺陷型菌株ER2799中,并进行草甘膦抗性鉴定.结果显示,Phe114、Ala355和His356等氨基酸的突变,使AM79 EPSPS蛋白的草甘膦抗性降低,表明这些氨基酸位点对于维持AM79 EPSPS高抗草甘膦的能力是必需的.同源建模结果表明,这些保守氨基酸位点的突变,使AM79 EPSPS蛋白的结构发生变化,这可能是导致突变蛋白草甘膦抗性能力降低的原因.两个Ⅰ型EPSPS(荧光假单杆菌(Pseudomonas fluorescens)G2 EPSPS和拟南芥(Arabidopsis thaliana) EPSPS)对应氨基酸突变后,其草甘膦抗性没有明显变化,表明AM79 EPSPS中几个特异的氨基酸位点的功能在Ⅰ型EPSPS中并不是保守的.本研究结果为解析AM79 EPSPS高抗草甘膦的作用机理及对AM79 EPSPS进行定向进化提供了理论依据.
AM79 aroA (WO/2009/059485)기인시종초감련고도오염적토양중극륭적、구유아국자주지식산권적신형초감련항성기인,구유중요응용개치.위진일보해석AM79 EPSPS단백적작용궤제,본연구대차단백적활성위점진행료연구.진화수분석현시AM79 EPSPS속우Ⅰ형EPSPS.서렬비대결과표명AM79 EPSPS중제107위적병안산(Ala),제114위적분병안산(Phe),제355위적Ala화제356위적조안산(His)시특이적.채용중첩연신PCR개도적핵감산정점돌변기술,대저사보수적안기산위점진행정점돌변.장AM79 aroA급기돌변기인전입대장간균(Escherichia coli)aroA결함형균주ER2799중,병진행초감련항성감정.결과현시,Phe114、Ala355화His356등안기산적돌변,사AM79 EPSPS단백적초감련항성강저,표명저사안기산위점대우유지AM79 EPSPS고항초감련적능력시필수적.동원건모결과표명,저사보수안기산위점적돌변,사AM79 EPSPS단백적결구발생변화,저가능시도치돌변단백초감련항성능력강저적원인.량개Ⅰ형EPSPS(형광가단간균(Pseudomonas fluorescens)G2 EPSPS화의남개(Arabidopsis thaliana) EPSPS)대응안기산돌변후,기초감련항성몰유명현변화,표명AM79 EPSPS중궤개특이적안기산위점적공능재Ⅰ형EPSPS중병불시보수적.본연구결과위해석AM79 EPSPS고항초감련적작용궤리급대AM79 EPSPS진행정향진화제공료이론의거.