高技术通讯
高技術通訊
고기술통신
HIGH TECHNOLOGY LETTERS
2014年
12期
1306-1313
,共8页
王茜%姚明泽%宋玛丽%付月君%胡风云%梁爱华
王茜%姚明澤%宋瑪麗%付月君%鬍風雲%樑愛華
왕천%요명택%송마려%부월군%호풍운%량애화
大肠杆菌植酸酶AppA%定点突变%热稳定性%N-糖基化%毕赤酵母
大腸桿菌植痠酶AppA%定點突變%熱穩定性%N-糖基化%畢赤酵母
대장간균식산매AppA%정점돌변%열은정성%N-당기화%필적효모
Escherichia coli phytase AppA%site-directed mutagenesis%thermostability%N-glycosylation%Pichia pastoris
为提高大肠杆菌植酸酶AppA(一种已得到广泛应用的饲料添加剂,其酶活高,pH作用范围广,但热稳定性较差)热稳定性,在appA基因上组合突变了W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N和Q349N等10个位点,突变后的基因命名为appAM10.将野生型appAppA和突变体appAM10ppAM10基因转入毕赤酵母GS115进行表达,并对重组蛋白AppA和AppAM10进行了酶学性质研究与比较.结果表明:AppAM 10分子量约为55kDa,比活性为3022U/mg,AppAM10的Km=330μmol/L,Vmax=3147 U/mg.AppAM10的最适pH值为4.5,最适反应温度为65℃.与野生型的AppA的最适pH无明显区别,比AppA的最适温度提高了5℃.经90℃孵育15min后,AppA完全失活,而AppAM10仍残留17.5％的活性,Tm值提高约8℃,说明上述10个位点的组合突变有利于提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性,其中与N-糖基化有关的N204C、Q258N和Q349N3个位点可能起着重要作用.
為提高大腸桿菌植痠酶AppA(一種已得到廣汎應用的飼料添加劑,其酶活高,pH作用範圍廣,但熱穩定性較差)熱穩定性,在appA基因上組閤突變瞭W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N和Q349N等10箇位點,突變後的基因命名為appAM10.將野生型appAppA和突變體appAM10ppAM10基因轉入畢赤酵母GS115進行錶達,併對重組蛋白AppA和AppAM10進行瞭酶學性質研究與比較.結果錶明:AppAM 10分子量約為55kDa,比活性為3022U/mg,AppAM10的Km=330μmol/L,Vmax=3147 U/mg.AppAM10的最適pH值為4.5,最適反應溫度為65℃.與野生型的AppA的最適pH無明顯區彆,比AppA的最適溫度提高瞭5℃.經90℃孵育15min後,AppA完全失活,而AppAM10仍殘留17.5％的活性,Tm值提高約8℃,說明上述10箇位點的組閤突變有利于提高大腸桿菌植痠酶AppA熱穩定性,其中與N-糖基化有關的N204C、Q258N和Q349N3箇位點可能起著重要作用.
위제고대장간균식산매AppA(일충이득도엄범응용적사료첨가제,기매활고,pH작용범위엄,단열은정성교차)열은정성,재appA기인상조합돌변료W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N화Q349N등10개위점,돌변후적기인명명위appAM10.장야생형appAppA화돌변체appAM10ppAM10기인전입필적효모GS115진행표체,병대중조단백AppA화AppAM10진행료매학성질연구여비교.결과표명:AppAM 10분자량약위55kDa,비활성위3022U/mg,AppAM10적Km=330μmol/L,Vmax=3147 U/mg.AppAM10적최괄pH치위4.5,최괄반응온도위65℃.여야생형적AppA적최괄pH무명현구별,비AppA적최괄온도제고료5℃.경90℃부육15min후,AppA완전실활,이AppAM10잉잔류17.5％적활성,Tm치제고약8℃,설명상술10개위점적조합돌변유리우제고대장간균식산매AppA열은정성,기중여N-당기화유관적N204C、Q258N화Q349N3개위점가능기착중요작용.
