CAJ | 학술논문

[目的]通过建立酵母单杂交文库筛选出与毛白杨特异性调控元件结合的候选蛋白,为研究毛白杨木材合成相关基因奠定基础.[方法]采用模板基因PCR方法,分别将ABRE-box、AC-box及-317-Box三次重复序列连接至pAbAi诱饵质粒上,再将诱饵载体转入酵母中;使用磁珠法获得mRNA,采用SMART技术合成cDNA,以cDNA为模板进行LD-PCR并将产物纯化后与pGADT7-Rec载体共转化诱饵酵母,同时进行文库的构建与筛选.[结果]以pBI121质粒为模板扩增获得的ABRE/AC/-317-GUS片段约为650 bp.以Kpn I对重组质粒pAbAi-ABRE/AC/-317-GUS进行单酶切,获得约5000 bp的大片段与650 bp的小片段;测序结果表明,插入序列与ABRE/AC/-317序列一致且方向正确.在SD/Ura培养基中,当AbA为100 ng/mL时,酵母菌落数为0,建库时AbA为100 ng/mL.cDNA与pGADT7载体共转化的酵母Y 1HGold(pAC-AbAi)细胞稀释100倍后,在SD/-Leu培养基上长出89个克隆,含AC-box的诱饵酵母所建库容量为1.3×106,且无rRNA污染.酵母转化产物在SD/-Leu/AbA(100 ng/mL)培养基上长出18个克隆,大于250 bp的有13个克隆;测序和同源分析结果表明,成功筛选到5个候选蛋白,主要是蛋白激酶、核小体蛋白及功能未知蛋白,这些蛋白可作为与AC元件结合的候选蛋白.[结论]建立的毛白杨酵母单杂体系可用于进一步筛选与木材合成相关的基因.
[목적]통과건립효모단잡교문고사선출여모백양특이성조공원건결합적후선단백,위연구모백양목재합성상관기인전정기출.[방법]채용모판기인PCR방법,분별장ABRE-box、AC-box급-317-Box삼차중복서렬련접지pAbAi유이질립상,재장유이재체전입효모중;사용자주법획득mRNA,채용SMART기술합성cDNA,이cDNA위모판진행LD-PCR병장산물순화후여pGADT7-Rec재체공전화유이효모,동시진행문고적구건여사선.[결과]이pBI121질립위모판확증획득적ABRE/AC/-317-GUS편단약위650 bp.이Kpn I대중조질립pAbAi-ABRE/AC/-317-GUS진행단매절,획득약5000 bp적대편단여650 bp적소편단;측서결과표명,삽입서렬여ABRE/AC/-317서렬일치차방향정학.재SD/Ura배양기중,당AbA위100 ng/mL시,효모균락수위0,건고시AbA위100 ng/mL.cDNA여pGADT7재체공전화적효모Y 1HGold(pAC-AbAi)세포희석100배후,재SD/-Leu배양기상장출89개극륭,함AC-box적유이효모소건고용량위1.3×106,차무rRNA오염.효모전화산물재SD/-Leu/AbA(100 ng/mL)배양기상장출18개극륭,대우250 bp적유13개극륭;측서화동원분석결과표명,성공사선도5개후선단백,주요시단백격매、핵소체단백급공능미지단백,저사단백가작위여AC원건결합적후선단백.[결론]건립적모백양효모단잡체계가용우진일보사선여목재합성상관적기인.