医学研究生学报
醫學研究生學報
의학연구생학보
JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATE
2015年
6期
594-599
,共6页
江罗佳%杨丽萍%吴险峰%黄翀%秦晓华%房向东%涂卫平
江囉佳%楊麗萍%吳險峰%黃翀%秦曉華%房嚮東%塗衛平
강라가%양려평%오험봉%황충%진효화%방향동%도위평
RhoA/ROCK信号通路%清蛋白%HK-2细胞%IL-6%肿瘤坏死因子α%rHuEPO
RhoA/ROCK信號通路%清蛋白%HK-2細胞%IL-6%腫瘤壞死因子α%rHuEPO
RhoA/ROCK신호통로%청단백%HK-2세포%IL-6%종류배사인자α%rHuEPO
RhoA/ROCK signaling pathway%Albumin%HK-2 cells%Interleukin-6%Tumor necrosis factor-α%recombinant human erythropoietin
目的：临床治疗虽可延缓肾间质纤维化进展，却无法逆转肾功能丧失。探讨重组人促红细胞生成素（ recombi-nant human erythropoietin ， rHuEPO）对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组：空白对照组、rHuEPO对照组（20 U／mL rHuEPO）、清蛋白刺激组（5 mg／mL清蛋白）、5 U／mL rHuEPO干预组（5 mg／mL清蛋白＋5 U／mL rHuEPO）、10 U／mL rHuEPO干预组（5 mg／mL清蛋白＋10 U／mL rHuEPO）、20 U／mL rHuEPO干预组（5 mg／mL清蛋白＋20 U／mL rHuEPO）、Rho激酶抑制组（10μmol／L Y27632＋5 mg／mL清蛋白），各组均作用24 h。观察各组细胞形态的变化；RT-PCR检测各组细胞RhoA、ROCK1 mRNA及白细胞介素-6因子（ interleukin-6， IL-6） mRNA含量水平；ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor ， TNF-α）、IL-6蛋白的含量表达。结果空白对照组、rHuEPO干预组显示鹅卵石或者铺路石样形态，清蛋白刺激组表现出细长梭状改变，呈现纤维细胞样外观。5、10、20 U／mL rHuEPO干预组细胞向鹅卵石样复转，Rho激酶抑制组细胞形态呈椭圆形、细胞间隙稍增大；与空白对照组比较，清蛋白刺激组RhoA、ROCK1 mRNA及IL-6 mRNA显著升高（P＜0．05），而5、10、20 U／mL rHuEPO干预组逐渐下调（P＜0．05），且与rHuEPO浓度负相关；与清蛋白刺激组比较，Rho激酶抑制组ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA表达下调（P＜0．05），但RhoA mRNA表达差异无统计学意义（P＞0．05）。 ELISA结果显示：清蛋白刺激组上清液TNF-α、IL-6蛋白[（1347．54±41．52） ng／L、（884．62±0．73） pg／L]表达较空白对照组[（452．32±33．23） ng／L，（95．12±0．32） pg／L]显著增高（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO干预组、Rho激酶抑制组TNF-α表达[（1003．32±3．42）、（821．32±21．32）、（590．15±7．68）、（488．13±65．03）ng／L）]较清蛋白刺激组[（1347．54±41．52） ng／L]下降（P ＜0．05）、IL-6蛋白表达[（656．68±0．55）、（422．35±0．22）、（217．32±0．35）、（309．49±0．21）pg／L]亦较清蛋白刺激组[（884．62±0．73）pg／L]下降（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO干预组组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论 rHuEPO可能通过减少炎症因子的产生来抑制清蛋白诱导的HK-2细胞转分化过程，其作用机制部分涉及RhoA／ROCK信号通路。
目的：臨床治療雖可延緩腎間質纖維化進展，卻無法逆轉腎功能喪失。探討重組人促紅細胞生成素（ recombi-nant human erythropoietin ， rHuEPO）對腎間質纖維化過程中炎癥因子的影響及其可能作用機製。方法將體外培養的HK-2細胞隨機分為7組：空白對照組、rHuEPO對照組（20 U／mL rHuEPO）、清蛋白刺激組（5 mg／mL清蛋白）、5 U／mL rHuEPO榦預組（5 mg／mL清蛋白＋5 U／mL rHuEPO）、10 U／mL rHuEPO榦預組（5 mg／mL清蛋白＋10 U／mL rHuEPO）、20 U／mL rHuEPO榦預組（5 mg／mL清蛋白＋20 U／mL rHuEPO）、Rho激酶抑製組（10μmol／L Y27632＋5 mg／mL清蛋白），各組均作用24 h。觀察各組細胞形態的變化；RT-PCR檢測各組細胞RhoA、ROCK1 mRNA及白細胞介素-6因子（ interleukin-6， IL-6） mRNA含量水平；ELISA檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子（ tumor necrosis factor ， TNF-α）、IL-6蛋白的含量錶達。結果空白對照組、rHuEPO榦預組顯示鵝卵石或者鋪路石樣形態，清蛋白刺激組錶現齣細長梭狀改變，呈現纖維細胞樣外觀。5、10、20 U／mL rHuEPO榦預組細胞嚮鵝卵石樣複轉，Rho激酶抑製組細胞形態呈橢圓形、細胞間隙稍增大；與空白對照組比較，清蛋白刺激組RhoA、ROCK1 mRNA及IL-6 mRNA顯著升高（P＜0．05），而5、10、20 U／mL rHuEPO榦預組逐漸下調（P＜0．05），且與rHuEPO濃度負相關；與清蛋白刺激組比較，Rho激酶抑製組ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA錶達下調（P＜0．05），但RhoA mRNA錶達差異無統計學意義（P＞0．05）。 ELISA結果顯示：清蛋白刺激組上清液TNF-α、IL-6蛋白[（1347．54±41．52） ng／L、（884．62±0．73） pg／L]錶達較空白對照組[（452．32±33．23） ng／L，（95．12±0．32） pg／L]顯著增高（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO榦預組、Rho激酶抑製組TNF-α錶達[（1003．32±3．42）、（821．32±21．32）、（590．15±7．68）、（488．13±65．03）ng／L）]較清蛋白刺激組[（1347．54±41．52） ng／L]下降（P ＜0．05）、IL-6蛋白錶達[（656．68±0．55）、（422．35±0．22）、（217．32±0．35）、（309．49±0．21）pg／L]亦較清蛋白刺激組[（884．62±0．73）pg／L]下降（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO榦預組組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0．05）。結論 rHuEPO可能通過減少炎癥因子的產生來抑製清蛋白誘導的HK-2細胞轉分化過程，其作用機製部分涉及RhoA／ROCK信號通路。
목적：림상치료수가연완신간질섬유화진전，각무법역전신공능상실。탐토중조인촉홍세포생성소（ recombi-nant human erythropoietin ， rHuEPO）대신간질섬유화과정중염증인자적영향급기가능작용궤제。방법장체외배양적HK-2세포수궤분위7조：공백대조조、rHuEPO대조조（20 U／mL rHuEPO）、청단백자격조（5 mg／mL청단백）、5 U／mL rHuEPO간예조（5 mg／mL청단백＋5 U／mL rHuEPO）、10 U／mL rHuEPO간예조（5 mg／mL청단백＋10 U／mL rHuEPO）、20 U／mL rHuEPO간예조（5 mg／mL청단백＋20 U／mL rHuEPO）、Rho격매억제조（10μmol／L Y27632＋5 mg／mL청단백），각조균작용24 h。관찰각조세포형태적변화；RT-PCR검측각조세포RhoA、ROCK1 mRNA급백세포개소-6인자（ interleukin-6， IL-6） mRNA함량수평；ELISA검측세포상청액중종류배사인자（ tumor necrosis factor ， TNF-α）、IL-6단백적함량표체。결과공백대조조、rHuEPO간예조현시아란석혹자포로석양형태，청단백자격조표현출세장사상개변，정현섬유세포양외관。5、10、20 U／mL rHuEPO간예조세포향아란석양복전，Rho격매억제조세포형태정타원형、세포간극초증대；여공백대조조비교，청단백자격조RhoA、ROCK1 mRNA급IL-6 mRNA현저승고（P＜0．05），이5、10、20 U／mL rHuEPO간예조축점하조（P＜0．05），차여rHuEPO농도부상관；여청단백자격조비교，Rho격매억제조ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA표체하조（P＜0．05），단RhoA mRNA표체차이무통계학의의（P＞0．05）。 ELISA결과현시：청단백자격조상청액TNF-α、IL-6단백[（1347．54±41．52） ng／L、（884．62±0．73） pg／L]표체교공백대조조[（452．32±33．23） ng／L，（95．12±0．32） pg／L]현저증고（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO간예조、Rho격매억제조TNF-α표체[（1003．32±3．42）、（821．32±21．32）、（590．15±7．68）、（488．13±65．03）ng／L）]교청단백자격조[（1347．54±41．52） ng／L]하강（P ＜0．05）、IL-6단백표체[（656．68±0．55）、（422．35±0．22）、（217．32±0．35）、（309．49±0．21）pg／L]역교청단백자격조[（884．62±0．73）pg／L]하강（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO간예조조간량량비교차이균유통계학의의（P＜0．05）。결론 rHuEPO가능통과감소염증인자적산생래억제청단백유도적HK-2세포전분화과정，기작용궤제부분섭급RhoA／ROCK신호통로。
Objective Clinical treatment can delay the development of renal interstitial fibrosis , but it can not reverse renal dysfuntion.The article was to discuss the influence of recombinant human erythropoietin ( rHuEPO ) on inflammatory factors in the process of renal interstitial fibrosis and its possible mechanism . Methods The vitro cultured HK-2 cells were randomized into 7 groups:the blank control group , rHuEPO control group ( addition of 20U/mL rHuEPO), albumin stimulation group (addition of 5mg/mL albumin), 5mg/mL rHuEPO intervention group (5mg/mL albumin +5U/mL rHuEPO), 10 U/mL rHuEPO intervention group (5mg/mL albumin +10 U/mL rHuEPO), 20U/mL rHuEPO intervention group (5mg/mL albumin +20U/mL rHuEPO), and Rho inhibi-taion group (addition of 5mg/mL albumin 30min after 10μmol/L Y27632), 24 h acting time for each group.We observed the changes of cell morphology in each group .Reverse transcription polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to evaluate the mRNA levels of RhoA, ROCK1 and IL-6 , and ELISA was applied to measure the levels of supernatant TNF-αand IL-6 protein. Results The form of pebbles or paving stone was observed in blank control group and rHuEPO intervention groups , a long and thin spindle change with the appearance of fibre cells in albumin stimulation group , the transformation to pebbles in 5, 10, 20 mg/mL rHuEPO intervention groups , the form of oval and slightly increased intercellular space in Rho inhibitaion group .Compared with the blank control group , the expressions of RhoA mRNA, ROCK1 mRNA and IL-6 mRNA significantly increased in the albumin stimulation group (P<0.05), while significantly reduced in 5, 10, 20 mg/mL rHuEPO intervention groups (P<0.05), which was in negative relation with the rHuEPO concentrations .Compared with the albumin stimulation group , the expressions of ROCK 1 mRNA and IL-6 mRNA reduced in Rho inhibtation group (P<0.05), while there was no significant difference as to the expression of RhoA mRNA .ELISA results showed:compared with blank control group , the expressions of supernatant TNF-α([452.32 ±33.23] ng/L vs [1347.54 ±41.52] ng/L), IL-6 protein([884.62 ±0.73] pg/L vs [95.12 ±0.32]pg/LP<0.05) increased significantly.Compared with albumin stim-ulation group, the expressions of TNF-αin 5, 10, 20 mg/mL rHuEPO intervention groups and Rho inhibitation group reduced signifi-cantly([1003.32 ±3.42] ng/L, [821.32 ±21.32] ng/L, [590.15 ±7.68] ng/L, [488.13 ±65.03] ng/L vs [1 347.54 ± 41.52]ng/L,P<0.05), while the expressions of IL-6 mRNA reduced accordingly in 5, 10, 20 mg/mL rHuEPO intervention groups and Rho inhibitation group reduced significantly ([656.68 ±0.55] pg/L, [422.35 ±0.22] pg/L, [217.32 ±0.35] pg/L, [309.49 ±0.21] pg/L vs [884.62 ±0.73]pg/L,P<0.05).Moreover, there was significant statistical difference among 5, 10, 20 mg/mL rHuEPO intervention groups(P<0.05). Conclusion RHuEPO can inhibit the transdifferentiation process of HK-2 cells in-duced by albumin by suppressing inflammation factors , and the mechanism may be involved in RhoA/ROCK signaling pathway .
