生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2015年
3期
325-328
,共4页
杜佩云%程龙%姜丽娜%陈立涵%林佳佳%叶棋浓%苏金为
杜珮雲%程龍%薑麗娜%陳立涵%林佳佳%葉棋濃%囌金為
두패운%정룡%강려나%진립함%림가가%협기농%소금위
雌激素受体α%肿瘤干细胞%短发夹RNA%流式细胞术
雌激素受體α%腫瘤榦細胞%短髮夾RNA%流式細胞術
자격소수체α%종류간세포%단발협RNA%류식세포술
estrogen receptor α%breast cancer stem cells%shRNA interference%flow cytometry
目的:构建特异抑制雌激素受体α(ERα)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,检测其对ERα的干扰效果,并探讨其对MCF7细胞中乳腺癌干细胞含量的影响.方法:以人的ERα核酸序列为靶标,根据shRNA设计原则设计并化学合成特异的shRNA序列,经退火处理后与pSIH-H1质粒连接,转化大肠杆菌DHSα后挑取单克隆并测序;将该克隆进行病毒包装并感染乳腺癌MCF7细胞,用嘌呤霉素进行筛选,最终得到稳定克隆;收取细胞,用Western印迹和qRT-PCR检测ERα在mRNA及蛋白水平上的变化,流式细胞术检测敲低ERα能否影响MCF7乳腺癌干细胞的含量.结果:经测序分析表明目标shRNA序列成功插入载体,qRT-PCR检测稳定克隆,发现该shRNA能有效抑制目的基因的mRNA转录水平,同时Western印迹检测发现内源性ERα量明显下降;流式细胞术检测发现ERα敲低的MCF7稳定克隆中雌激素诱导的乳腺癌干细胞含量上升的现象被明显抑制.结论:设计并构建的抑制ERα的shRNA能够有效抑制ERα的表达,并下调MCF7细胞中乳腺癌干细胞的含量,为研究ERα在乳腺癌干细胞中的功能及机制奠定了实验基础.
目的:構建特異抑製雌激素受體α(ERα)基因的短髮夾RNA(shRNA)慢病毒錶達載體,檢測其對ERα的榦擾效果,併探討其對MCF7細胞中乳腺癌榦細胞含量的影響.方法:以人的ERα覈痠序列為靶標,根據shRNA設計原則設計併化學閤成特異的shRNA序列,經退火處理後與pSIH-H1質粒連接,轉化大腸桿菌DHSα後挑取單剋隆併測序;將該剋隆進行病毒包裝併感染乳腺癌MCF7細胞,用嘌呤黴素進行篩選,最終得到穩定剋隆;收取細胞,用Western印跡和qRT-PCR檢測ERα在mRNA及蛋白水平上的變化,流式細胞術檢測敲低ERα能否影響MCF7乳腺癌榦細胞的含量.結果:經測序分析錶明目標shRNA序列成功插入載體,qRT-PCR檢測穩定剋隆,髮現該shRNA能有效抑製目的基因的mRNA轉錄水平,同時Western印跡檢測髮現內源性ERα量明顯下降;流式細胞術檢測髮現ERα敲低的MCF7穩定剋隆中雌激素誘導的乳腺癌榦細胞含量上升的現象被明顯抑製.結論:設計併構建的抑製ERα的shRNA能夠有效抑製ERα的錶達,併下調MCF7細胞中乳腺癌榦細胞的含量,為研究ERα在乳腺癌榦細胞中的功能及機製奠定瞭實驗基礎.
목적:구건특이억제자격소수체α(ERα)기인적단발협RNA(shRNA)만병독표체재체,검측기대ERα적간우효과,병탐토기대MCF7세포중유선암간세포함량적영향.방법:이인적ERα핵산서렬위파표,근거shRNA설계원칙설계병화학합성특이적shRNA서렬,경퇴화처리후여pSIH-H1질립련접,전화대장간균DHSα후도취단극륭병측서;장해극륭진행병독포장병감염유선암MCF7세포,용표령매소진행사선,최종득도은정극륭;수취세포,용Western인적화qRT-PCR검측ERα재mRNA급단백수평상적변화,류식세포술검측고저ERα능부영향MCF7유선암간세포적함량.결과:경측서분석표명목표shRNA서렬성공삽입재체,qRT-PCR검측은정극륭,발현해shRNA능유효억제목적기인적mRNA전록수평,동시Western인적검측발현내원성ERα량명현하강;류식세포술검측발현ERα고저적MCF7은정극륭중자격소유도적유선암간세포함량상승적현상피명현억제.결론:설계병구건적억제ERα적shRNA능구유효억제ERα적표체,병하조MCF7세포중유선암간세포적함량,위연구ERα재유선암간세포중적공능급궤제전정료실험기출.
