CAJ | 학술논문

目的：通过观察乙酰肝素酶（HPA）抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞体外生长的抑制作用及HPA表达的影响，为子宫颈癌HPA分子靶向治疗提供理论依据。方法优化设计并合成了两个系列共13种1，3-O，N螺杂环类化合物，产品编号为10～22号，其中21号为HPA抑制剂——DMBO化合物，余12种为新合成的化合物。其中，1个系列含甲氧苯基，产品编号为10～14号；另1个系列不含甲氧苯基，产品编号为15～22号。（1）采用乙酰肝素降解检测试剂盒检测新合成的化合物（选择与DMBO结构类似度高的6个化合物，即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性的作用，以50%抑制浓度（IC50）表示作用的强弱；（2）四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测新合成的化合物（7个化合物，即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用后HeLa细胞生长的抑制作用，选择抑制作用最大的化合物（即16号化合物）用于以下实验；（3）细胞划痕实验观察16号化合物作用后HeLa细胞迁移能力的变化；（4）流式细胞仪检测16号化合物作用后HeLa细胞的细胞周期比例和细胞凋亡率的变化；（5）实时定量逆转录（RT）-PCR技术、蛋白印迹法和免疫组化法检测16号化合物作用后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白表达的变化。结果（1）6个新合成的化合物（即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性均有不同程度的抑制作用，除22号化合物抑制作用不明显无法测出IC50值外，14、15、16、20、21号化合物的IC50值分别为4.47、21.81、8.36、14.13、47.19μmol/L。（2）MTT比色法检测显示，不同浓度（分别为1、5、15、30、60、120、180、240μmol/L）的7个新合成的化合物（即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用48 h对HeLa细胞的生长均有抑制作用，并呈明显的浓度依赖性（P<0.01），其中16号化合物的抑制效果最显著（IC50值为48.16μmol/L）；进一步检测显示，16号化合物作用不同时间（分别为24、48、72、96 h）后对HeLa细胞生长的抑制作用呈明显的时间依赖性（P<0.01）。（3）细胞划痕实验观察显示，作用24 h后，实验组（加入50μmol/L的16号化合物，下同）HeLa细胞迁移能力明显受到抑制，其划痕的宽度明显大于对照组（不加16号化合物，下同）。（4）流式细胞仪检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞G0/G1期、G2/M期比例分别为（75.85±1.77）%、（11.65±0.64）%，均明显高于对照组[分别为（49.10±3.11）%、（0.17±0.24）%；P<0.01]；S期细胞比例为（12.50±1.13）%，明显低于对照组的（50.70±2.83）%（P=0.003）。实验组HeLa细胞的凋亡率为（11.9±1.2）%，明显高于对照组的（6.6±1.8）%（P=0.013）。（5）实时定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达水平分别为1.23±0.46和0.46±0.31，明显低于对照组的3.43±0.45和1.30±0.58（P<0.05）；免疫组化法检测显示，实验组累积吸光度（IA）值为0.39±0.04，对照组为0.50±0.09，两组比较，差异有统计学意义（P=0.026）。结论新型1，3-O，N螺杂环类HPA抑制剂可能通过凋亡途径显著抑制子宫颈癌HeLa细胞的生长；该类抑制剂可明显抑制HeLa细胞的HPA活性，并下调其HPA mRNA和蛋白的表达。目的：通過觀察乙酰肝素酶（HPA）抑製劑對子宮頸癌HeLa細胞體外生長的抑製作用及HPA錶達的影響，為子宮頸癌HPA分子靶嚮治療提供理論依據。方法優化設計併閤成瞭兩箇繫列共13種1，3-O，N螺雜環類化閤物，產品編號為10～22號，其中21號為HPA抑製劑——DMBO化閤物，餘12種為新閤成的化閤物。其中，1箇繫列含甲氧苯基，產品編號為10～14號；另1箇繫列不含甲氧苯基，產品編號為15～22號。（1）採用乙酰肝素降解檢測試劑盒檢測新閤成的化閤物（選擇與DMBO結構類似度高的6箇化閤物，即14、15、16、20、21、22號化閤物）對HPA活性的作用，以50%抑製濃度（IC50）錶示作用的彊弱；（2）四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測新閤成的化閤物（7箇化閤物，即11、12、14、15、16、20、22號化閤物）作用後HeLa細胞生長的抑製作用，選擇抑製作用最大的化閤物（即16號化閤物）用于以下實驗；（3）細胞劃痕實驗觀察16號化閤物作用後HeLa細胞遷移能力的變化；（4）流式細胞儀檢測16號化閤物作用後HeLa細胞的細胞週期比例和細胞凋亡率的變化；（5）實時定量逆轉錄（RT）-PCR技術、蛋白印跡法和免疫組化法檢測16號化閤物作用後HeLa細胞中HPA mRNA和蛋白錶達的變化。結果（1）6箇新閤成的化閤物（即14、15、16、20、21、22號化閤物）對HPA活性均有不同程度的抑製作用，除22號化閤物抑製作用不明顯無法測齣IC50值外，14、15、16、20、21號化閤物的IC50值分彆為4.47、21.81、8.36、14.13、47.19μmol/L。（2）MTT比色法檢測顯示，不同濃度（分彆為1、5、15、30、60、120、180、240μmol/L）的7箇新閤成的化閤物（即11、12、14、15、16、20、22號化閤物）作用48 h對HeLa細胞的生長均有抑製作用，併呈明顯的濃度依賴性（P<0.01），其中16號化閤物的抑製效果最顯著（IC50值為48.16μmol/L）；進一步檢測顯示，16號化閤物作用不同時間（分彆為24、48、72、96 h）後對HeLa細胞生長的抑製作用呈明顯的時間依賴性（P<0.01）。（3）細胞劃痕實驗觀察顯示，作用24 h後，實驗組（加入50μmol/L的16號化閤物，下同）HeLa細胞遷移能力明顯受到抑製，其劃痕的寬度明顯大于對照組（不加16號化閤物，下同）。（4）流式細胞儀檢測顯示，作用48 h後，實驗組HeLa細胞G0/G1期、G2/M期比例分彆為（75.85±1.77）%、（11.65±0.64）%，均明顯高于對照組[分彆為（49.10±3.11）%、（0.17±0.24）%；P<0.01]；S期細胞比例為（12.50±1.13）%，明顯低于對照組的（50.70±2.83）%（P=0.003）。實驗組HeLa細胞的凋亡率為（11.9±1.2）%，明顯高于對照組的（6.6±1.8）%（P=0.013）。（5）實時定量RT-PCR技術和蛋白印跡法檢測顯示，作用48 h後，實驗組HeLa細胞中HPA mRNA和蛋白的錶達水平分彆為1.23±0.46和0.46±0.31，明顯低于對照組的3.43±0.45和1.30±0.58（P<0.05）；免疫組化法檢測顯示，實驗組纍積吸光度（IA）值為0.39±0.04，對照組為0.50±0.09，兩組比較，差異有統計學意義（P=0.026）。結論新型1，3-O，N螺雜環類HPA抑製劑可能通過凋亡途徑顯著抑製子宮頸癌HeLa細胞的生長；該類抑製劑可明顯抑製HeLa細胞的HPA活性，併下調其HPA mRNA和蛋白的錶達。
목적：통과관찰을선간소매（HPA）억제제대자궁경암HeLa세포체외생장적억제작용급HPA표체적영향，위자궁경암HPA분자파향치료제공이론의거。방법우화설계병합성료량개계렬공13충1，3-O，N라잡배류화합물，산품편호위10～22호，기중21호위HPA억제제——DMBO화합물，여12충위신합성적화합물。기중，1개계렬함갑양분기，산품편호위10～14호；령1개계렬불함갑양분기，산품편호위15～22호。（1）채용을선간소강해검측시제합검측신합성적화합물（선택여DMBO결구유사도고적6개화합물，즉14、15、16、20、21、22호화합물）대HPA활성적작용，이50%억제농도（IC50）표시작용적강약；（2）사갑기우담서람（MTT）비색법검측신합성적화합물（7개화합물，즉11、12、14、15、16、20、22호화합물）작용후HeLa세포생장적억제작용，선택억제작용최대적화합물（즉16호화합물）용우이하실험；（3）세포화흔실험관찰16호화합물작용후HeLa세포천이능력적변화；（4）류식세포의검측16호화합물작용후HeLa세포적세포주기비례화세포조망솔적변화；（5）실시정량역전록（RT）-PCR기술、단백인적법화면역조화법검측16호화합물작용후HeLa세포중HPA mRNA화단백표체적변화。결과（1）6개신합성적화합물（즉14、15、16、20、21、22호화합물）대HPA활성균유불동정도적억제작용，제22호화합물억제작용불명현무법측출IC50치외，14、15、16、20、21호화합물적IC50치분별위4.47、21.81、8.36、14.13、47.19μmol/L。（2）MTT비색법검측현시，불동농도（분별위1、5、15、30、60、120、180、240μmol/L）적7개신합성적화합물（즉11、12、14、15、16、20、22호화합물）작용48 h대HeLa세포적생장균유억제작용，병정명현적농도의뢰성（P<0.01），기중16호화합물적억제효과최현저（IC50치위48.16μmol/L）；진일보검측현시，16호화합물작용불동시간（분별위24、48、72、96 h）후대HeLa세포생장적억제작용정명현적시간의뢰성（P<0.01）。（3）세포화흔실험관찰현시，작용24 h후，실험조（가입50μmol/L적16호화합물，하동）HeLa세포천이능력명현수도억제，기화흔적관도명현대우대조조（불가16호화합물，하동）。（4）류식세포의검측현시，작용48 h후，실험조HeLa세포G0/G1기、G2/M기비례분별위（75.85±1.77）%、（11.65±0.64）%，균명현고우대조조[분별위（49.10±3.11）%、（0.17±0.24）%；P<0.01]；S기세포비례위（12.50±1.13）%，명현저우대조조적（50.70±2.83）%（P=0.003）。실험조HeLa세포적조망솔위（11.9±1.2）%，명현고우대조조적（6.6±1.8）%（P=0.013）。（5）실시정량RT-PCR기술화단백인적법검측현시，작용48 h후，실험조HeLa세포중HPA mRNA화단백적표체수평분별위1.23±0.46화0.46±0.31，명현저우대조조적3.43±0.45화1.30±0.58（P<0.05）；면역조화법검측현시，실험조루적흡광도（IA）치위0.39±0.04，대조조위0.50±0.09，량조비교，차이유통계학의의（P=0.026）。결론신형1，3-O，N라잡배류HPA억제제가능통과조망도경현저억제자궁경암HeLa세포적생장；해류억제제가명현억제HeLa세포적HPA활성，병하조기HPA mRNA화단백적표체。
Objective To provide the theoretical supportting for targeted heparanase (HPA) inhibition of cervical cancer through observing the anti-proliferative effect of the HPA inhibitor on HeLa cell line of cervical cancer. Methods The two series of 13 kinds of novel HPA inhibitors were synthesized and optimized. Heparan degrading enzyme assay kit was used to test the effect of the inhibitors on the inhibition of HPA enzyme activity. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method and scratch test were used to observe the anti-proliferative and the migration effect of the inhibitors on HeLa cells. Flow cytometry was performed to determine the cell cycles and apoptosis. The expression of HPA was evaluated by reverse transcription (RT)-PCR, western blot and immunocytochemistry. Results All tested inhibitors could inhibit the activity of HPA enzyme [the range of 50% inhibiting concentration (IC50) values from 4.47 to 47.19 μmol/L] and the growth of HeLa cells (the range of IC50 values from 48.16 to 96.64μmol/L). Among them, No.16 compound exhibits the strongest inhibition against the growth of HeLa, which could arrest the cell into G0/G1 and G2/M phases. The rate of cell apoptosis in the group treated with 50μmol/L No.16 for 48 hours [(11.9±1.2)%] was significantly higher than that [(6.6 ± 1.8)%] in untreated group (P=0.013). Real time PCR and western blot showed that expression levels of HPA mRNA (1.23±0.46) and protein (0.46±0.31) significantly decreased in the treated group as compared with the levels of HPA mRNA (3.43 ± 0.45) and protein (1.30 ± 0.58) in the untreated group (both P<0.05). Immunocytochemistry also showed that the treatment of No.16 significantly reduced the average optical density (0.39 ± 0.04) of HPA immuostaining signal compared with that in the control group (0.50 ± 0.09; P=0.026). Conclusion Novel 1,3-O,N spiroheterocyclic HPA inhibitors could inhibit the proliferation of HeLa cells,inhibit the HPA enzyme activity in different degree, and down-regulate the expression of HPA protein.