CAJ | 학술논문

目的：构建CDK2 shRNA慢病毒载体，并在黑色素瘤细胞B16－F1中鉴定其基因沉默效应。方法体外构建3个慢病毒重组目的质粒pUL－CDK2－shRNAs和1个阴性对照慢病毒重组质粒pUL－NC－shRNA，转化感受态细胞，PCR鉴定后进一步测序验证；293T细胞中测定病毒滴度；用重组慢病毒感染B16－F1细胞测定其感染效率，RT－PCR和Western印迹检测其对 B16－F1细胞中CDK2的基因沉默效应。结果 PCR鉴定后进一步测序表明，成功构建了重组慢病毒质粒；病毒滴度为4．5×107～5．5×107 TU／ml；用重组慢病毒感染 B16－F1细胞，当感染复数（MOI）为10时，感染效率可达90％；RT－PCR和Western印迹结果表明，与未感染组和NC－shRNA感染组细胞相比，CDK2－shRNA1、CDK2－shRNA2、CDK2－shRNA3感染的细胞中CDK2 mRNA和蛋白表达均受到不同程度抑制（P＜0．05），以 CDK2－shRNA3感染组的抑制率最高，RT－PCR和 Western Blot 检测其抑制率分别为78．5％±4．23％和70．5％±3．54％。结论利用RNAi技术成功构建了3种CDK2－shRNA重组慢病毒载体，均可有效感染B16－F1细胞并具有一定的基因沉默效应，其中以针对靶位点1012－1020的pUL－CDK2－shRNA3基因沉默效应最强，为进一步研究CDK2基因沉默对黑色素瘤化疗敏感性的影响奠定了基础。
목적：구건CDK2 shRNA만병독재체，병재흑색소류세포B16－F1중감정기기인침묵효응。방법체외구건3개만병독중조목적질립pUL－CDK2－shRNAs화1개음성대조만병독중조질립pUL－NC－shRNA，전화감수태세포，PCR감정후진일보측서험증；293T세포중측정병독적도；용중조만병독감염B16－F1세포측정기감염효솔，RT－PCR화Western인적검측기대 B16－F1세포중CDK2적기인침묵효응。결과 PCR감정후진일보측서표명，성공구건료중조만병독질립；병독적도위4．5×107～5．5×107 TU／ml；용중조만병독감염 B16－F1세포，당감염복수（MOI）위10시，감염효솔가체90％；RT－PCR화Western인적결과표명，여미감염조화NC－shRNA감염조세포상비，CDK2－shRNA1、CDK2－shRNA2、CDK2－shRNA3감염적세포중CDK2 mRNA화단백표체균수도불동정도억제（P＜0．05），이 CDK2－shRNA3감염조적억제솔최고，RT－PCR화 Western Blot 검측기억제솔분별위78．5％±4．23％화70．5％±3．54％。결론이용RNAi기술성공구건료3충CDK2－shRNA중조만병독재체，균가유효감염B16－F1세포병구유일정적기인침묵효응，기중이침대파위점1012－1020적pUL－CDK2－shRNA3기인침묵효응최강，위진일보연구CDK2기인침묵대흑색소류화료민감성적영향전정료기출。