中国老年学杂志
中國老年學雜誌
중국노년학잡지
CHINESE JOURNAL OF GERONTOLOGY
2015年
16期
4465-4467
,共3页
孔令菊%周静%赵刚%姚素艳%郑德宇
孔令菊%週靜%趙剛%姚素豔%鄭德宇
공령국%주정%조강%요소염%정덕우
谷氨酸脱羧酶%小干扰RNA%基因沉默
穀氨痠脫羧酶%小榦擾RNA%基因沉默
곡안산탈최매%소간우RNA%기인침묵
目的：构建GAD65基因特异的siRNA并检测体外功能。方法应用RT－PCR方法克隆大鼠GAD65基因、测序、重组病毒包装检测体外功能。针对GAD65基因的编码区，设计3条 siRNA片段及一条对照片段，将其分别亚克隆于siRNA的慢病毒表达载体并小量包装获得病毒颗粒（ LV－GFP－siRNA－rGAD65）；用siRNA病毒颗粒感染GAD65过表达的293细胞，检测GAD65表达情况，从中筛选出高效特异的siRNA。大量包装特异的siRNA病毒颗粒，在体外感染培养的大脑皮质细胞，在体内注射到SD大鼠的苍白球内侧部，检测rGAD65的表达水平，观察 siRNA的功能。结果应用RT－PCR方法克隆rGAD65基因，其序列与 GenBank 中的基因序列几乎一致（99．72％），包装病毒后在293细胞中过表达。筛选出针对rGAD65的高效特异的siRNA，在GAD65基因的沉默效率可达到66％。在体外、体内分别应用Western印迹检测感染了LV－GFP－siRNA3－rGAD65的大脑皮质细胞和定点注射了LV－GFP－siRNA3－rGAD65的大鼠GPi。结论成功克隆rGAD65基因，设计、筛选出高效特异的 siRNA，并证明这种 siRNA在体内和体外均能有效地沉默rGAD65的表达。
目的：構建GAD65基因特異的siRNA併檢測體外功能。方法應用RT－PCR方法剋隆大鼠GAD65基因、測序、重組病毒包裝檢測體外功能。針對GAD65基因的編碼區，設計3條 siRNA片段及一條對照片段，將其分彆亞剋隆于siRNA的慢病毒錶達載體併小量包裝穫得病毒顆粒（ LV－GFP－siRNA－rGAD65）；用siRNA病毒顆粒感染GAD65過錶達的293細胞，檢測GAD65錶達情況，從中篩選齣高效特異的siRNA。大量包裝特異的siRNA病毒顆粒，在體外感染培養的大腦皮質細胞，在體內註射到SD大鼠的蒼白毬內側部，檢測rGAD65的錶達水平，觀察 siRNA的功能。結果應用RT－PCR方法剋隆rGAD65基因，其序列與 GenBank 中的基因序列幾乎一緻（99．72％），包裝病毒後在293細胞中過錶達。篩選齣針對rGAD65的高效特異的siRNA，在GAD65基因的沉默效率可達到66％。在體外、體內分彆應用Western印跡檢測感染瞭LV－GFP－siRNA3－rGAD65的大腦皮質細胞和定點註射瞭LV－GFP－siRNA3－rGAD65的大鼠GPi。結論成功剋隆rGAD65基因，設計、篩選齣高效特異的 siRNA，併證明這種 siRNA在體內和體外均能有效地沉默rGAD65的錶達。
목적：구건GAD65기인특이적siRNA병검측체외공능。방법응용RT－PCR방법극륭대서GAD65기인、측서、중조병독포장검측체외공능。침대GAD65기인적편마구，설계3조 siRNA편단급일조대조편단，장기분별아극륭우siRNA적만병독표체재체병소량포장획득병독과립（ LV－GFP－siRNA－rGAD65）；용siRNA병독과립감염GAD65과표체적293세포，검측GAD65표체정황，종중사선출고효특이적siRNA。대량포장특이적siRNA병독과립，재체외감염배양적대뇌피질세포，재체내주사도SD대서적창백구내측부，검측rGAD65적표체수평，관찰 siRNA적공능。결과응용RT－PCR방법극륭rGAD65기인，기서렬여 GenBank 중적기인서렬궤호일치（99．72％），포장병독후재293세포중과표체。사선출침대rGAD65적고효특이적siRNA，재GAD65기인적침묵효솔가체도66％。재체외、체내분별응용Western인적검측감염료LV－GFP－siRNA3－rGAD65적대뇌피질세포화정점주사료LV－GFP－siRNA3－rGAD65적대서GPi。결론성공극륭rGAD65기인，설계、사선출고효특이적 siRNA，병증명저충 siRNA재체내화체외균능유효지침묵rGAD65적표체。
