华中师范大学学报（自然科学版）
華中師範大學學報（自然科學版）
화중사범대학학보（자연과학판）
Journal of HuaZhong Normal University(Natural Sciences)
2015年
5期
758-762
,共5页
李景龙%袁永泽%李丹丹%杨雪婷%耿辉%熊丽%刘德立
李景龍%袁永澤%李丹丹%楊雪婷%耿輝%熊麗%劉德立
리경룡%원영택%리단단%양설정%경휘%웅려%류덕립
对硝基苯酚%偏苯三酚1,2-双加氧酶%表达纯化%催化特性
對硝基苯酚%偏苯三酚1,2-雙加氧酶%錶達純化%催化特性
대초기분분%편분삼분1,2-쌍가양매%표체순화%최화특성
p-nitrophenol%hydroxyquinol 1,2-dioxygenase%expression and purification%catalytic property
由pnpC编码的偏苯三酚1,2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase,PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)降解菌HS-D38(Pseudomohas sp.)中克隆pnpC基因,利用E.coli BL21 (DE3)高效表达重组PnpC,通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明:HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白相对分子量33 KD;20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropyl β-D-1 thiogalactopy-ranoside,IPTG)诱导可高效表达重组PnpC;重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯;纯酶比活力9.3 U/mg,纯化倍数37.2,活力收率23.8％;重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH5.0;Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95 mol/l、最大反应速度(Vmax)为2.68 mol/(min·mg);Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+对该酶具激活作用,Ni2+则显示抑制效应.
由pnpC編碼的偏苯三酚1,2-雙加氧酶(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase,PnpC)是微生物分解硝基芳香族類環境汙染物的關鍵酶.本研究從對硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)降解菌HS-D38(Pseudomohas sp.)中剋隆pnpC基因,利用E.coli BL21 (DE3)高效錶達重組PnpC,通過親和色譜純化併分析其催化特性.實驗結果錶明:HS-D36的pnpC開放閱讀框長度為873 bp,編碼290箇氨基痠,酶蛋白相對分子量33 KD;20℃、異丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropyl β-D-1 thiogalactopy-ranoside,IPTG)誘導可高效錶達重組PnpC;重組酶經Ni-NTA親和色譜一步分離可達到電泳純;純酶比活力9.3 U/mg,純化倍數37.2,活力收率23.8％;重組PnpC催化鄰苯二酚開環反應的最適溫度45℃、最適pH5.0;Lineweaver-Burk雙倒數作圖錶明PnpC對鄰苯二酚降解的米氏常數(Km)為21.95 mol/l、最大反應速度(Vmax)為2.68 mol/(min·mg);Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+對該酶具激活作用,Ni2+則顯示抑製效應.
유pnpC편마적편분삼분1,2-쌍가양매(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase,PnpC)시미생물분해초기방향족류배경오염물적관건매.본연구종대초기분분(p-nitrophenol,PNP)강해균HS-D38(Pseudomohas sp.)중극륭pnpC기인,이용E.coli BL21 (DE3)고효표체중조PnpC,통과친화색보순화병분석기최화특성.실험결과표명:HS-D36적pnpC개방열독광장도위873 bp,편마290개안기산,매단백상대분자량33 KD;20℃、이병기류대-β-반유당감(Isopropyl β-D-1 thiogalactopy-ranoside,IPTG)유도가고효표체중조PnpC;중조매경Ni-NTA친화색보일보분리가체도전영순;순매비활력9.3 U/mg,순화배수37.2,활력수솔23.8％;중조PnpC최화린분이분개배반응적최괄온도45℃、최괄pH5.0;Lineweaver-Burk쌍도수작도표명PnpC대린분이분강해적미씨상수(Km)위21.95 mol/l、최대반응속도(Vmax)위2.68 mol/(min·mg);Fe3+、Cu2+、Fe2+화Zn2+대해매구격활작용,Ni2+칙현시억제효응.
