徐州医学院学报
徐州醫學院學報
서주의학원학보
Acta Academiae Medicinae Xuzhou
2015年
8期
507-512
,共6页
Kif18A%SUMO化修饰%细胞周期
Kif18A%SUMO化脩飾%細胞週期
Kif18A%SUMO화수식%세포주기
Kif18A%SUMOylation%cell cycle
目的：探讨 Kif18A 的 SUMO 化修饰及其调控机制。方法在 HEK293T 细胞中共转染 Flag －Kif18A、HA －SUMO1或 His －SUMO1质粒，免疫沉淀富集 Flag －Kif18A，免疫印迹检测 HA －SUMO；用 TALON 树脂富集His －SUMO1蛋白，免疫印迹检测 Flag －Kif18A 考察 Kif18A 的 SUMO 化水平。利用 SUMOsp 2．0软件预测Kif18A 可能发生 SUMO 化的潜在位点，将 Flag －Kif18A 质粒中的相应位点上的编码序列由 Lys 突变成 Arg，在HEK293T 细胞中表达突变体后再检测 Kif18A 的 SUMO 化水平的变化来确定 Kif18A 的 SUMO 化位点。通过在HEK293T 细胞中共染转 Flag －Kif18A、HA －SUMO1以及 SENP1野生型（WT）或 SENP1酶活位点突变型（Mut）质粒，再采用免疫沉淀和免疫印迹检测 Kif18A 的 SUMO 化水平，来证明 SENP1是 Kif18A 的去 SUMO 化蛋白酶。最后，用 Nocodazole 处理 HeLa 细胞，使其同步化在 G2／M 阶段，再考察 G2／M 期 HeLa 细胞中 Kif18A 的 SUMO 化水平。结果Kif18A 能被 SUMO1或者 SUMO2修饰，K47和 K148是 Kif18A 发生 SUMO 化的两个主要位点，SENP1催化 Kif18A 的去 SUMO 化修饰。 HeLa 细胞同步化在 G2／M 期后，Kif18A 的 SUMO 化水平显著下降。结论Kif18A 能发生 SUMO 化修饰，且其 SUMO 化受到细胞有丝分裂进程的调控。
目的：探討 Kif18A 的 SUMO 化脩飾及其調控機製。方法在 HEK293T 細胞中共轉染 Flag －Kif18A、HA －SUMO1或 His －SUMO1質粒，免疫沉澱富集 Flag －Kif18A，免疫印跡檢測 HA －SUMO；用 TALON 樹脂富集His －SUMO1蛋白，免疫印跡檢測 Flag －Kif18A 攷察 Kif18A 的 SUMO 化水平。利用 SUMOsp 2．0軟件預測Kif18A 可能髮生 SUMO 化的潛在位點，將 Flag －Kif18A 質粒中的相應位點上的編碼序列由 Lys 突變成 Arg，在HEK293T 細胞中錶達突變體後再檢測 Kif18A 的 SUMO 化水平的變化來確定 Kif18A 的 SUMO 化位點。通過在HEK293T 細胞中共染轉 Flag －Kif18A、HA －SUMO1以及 SENP1野生型（WT）或 SENP1酶活位點突變型（Mut）質粒，再採用免疫沉澱和免疫印跡檢測 Kif18A 的 SUMO 化水平，來證明 SENP1是 Kif18A 的去 SUMO 化蛋白酶。最後，用 Nocodazole 處理 HeLa 細胞，使其同步化在 G2／M 階段，再攷察 G2／M 期 HeLa 細胞中 Kif18A 的 SUMO 化水平。結果Kif18A 能被 SUMO1或者 SUMO2脩飾，K47和 K148是 Kif18A 髮生 SUMO 化的兩箇主要位點，SENP1催化 Kif18A 的去 SUMO 化脩飾。 HeLa 細胞同步化在 G2／M 期後，Kif18A 的 SUMO 化水平顯著下降。結論Kif18A 能髮生 SUMO 化脩飾，且其 SUMO 化受到細胞有絲分裂進程的調控。
목적：탐토 Kif18A 적 SUMO 화수식급기조공궤제。방법재 HEK293T 세포중공전염 Flag －Kif18A、HA －SUMO1혹 His －SUMO1질립，면역침정부집 Flag －Kif18A，면역인적검측 HA －SUMO；용 TALON 수지부집His －SUMO1단백，면역인적검측 Flag －Kif18A 고찰 Kif18A 적 SUMO 화수평。이용 SUMOsp 2．0연건예측Kif18A 가능발생 SUMO 화적잠재위점，장 Flag －Kif18A 질립중적상응위점상적편마서렬유 Lys 돌변성 Arg，재HEK293T 세포중표체돌변체후재검측 Kif18A 적 SUMO 화수평적변화래학정 Kif18A 적 SUMO 화위점。통과재HEK293T 세포중공염전 Flag －Kif18A、HA －SUMO1이급 SENP1야생형（WT）혹 SENP1매활위점돌변형（Mut）질립，재채용면역침정화면역인적검측 Kif18A 적 SUMO 화수평，래증명 SENP1시 Kif18A 적거 SUMO 화단백매。최후，용 Nocodazole 처리 HeLa 세포，사기동보화재 G2／M 계단，재고찰 G2／M 기 HeLa 세포중 Kif18A 적 SUMO 화수평。결과Kif18A 능피 SUMO1혹자 SUMO2수식，K47화 K148시 Kif18A 발생 SUMO 화적량개주요위점，SENP1최화 Kif18A 적거 SUMO 화수식。 HeLa 세포동보화재 G2／M 기후，Kif18A 적 SUMO 화수평현저하강。결론Kif18A 능발생 SUMO 화수식，차기 SUMO 화수도세포유사분렬진정적조공。
Objective To investigate the SUMOylation of Kif18A and its regulatory mechanism.Methods Plas-mids Flag -Kif18A and HA -SUMO1 or His -SUMO1 were co -transfected into HEK293T cells.Flag -Kif18A proteins were pulled down by Flag M2 beads and its SUMOylation was detected by immunoblotting with anti -HA.His -SUMO1 conjugated proteins were also precipitated by TALON Resin and the level of SUMOylated Kif18A was detected by immno-blotting with Flag antibody.The potential sites of Kif18A SUMOlation were predicted by SUMOsp 2.0 software and its coding sequences were mutated from lysine to arginine on the Flag -Kif18A plasmid.Kif18A wide and mutant types were separately expressed in HEK293T cells.The change in the quantity of SUMOylated Kif18A was adopted to determine the site of SUMOylation in Flag -Kif18A.Furthermore, plasmids Flag -Kif18A, HA -SUMO1 and SENP1 WT or mutant were co -transfected into HEK293T cells.Then the amount of SUMOylated Kif18A was detected by immunoprecipitation to determine whether Kif18A can be de -SUMOylated by SENP1.Finally, HeLa cells were synchronized in G2 /M phase by Nocodazole treatment.The SUMOylation of Kif18A in HeLa cells in G2 /M phase were detected by immunoprecipitati-on and immunobloting.Results Kif18A could be SUMOylated by SUMO1 or SUMO2.K47 and K148 were two impor-tant sites for Kif18A SUMOylation.Besides, Kif18A could be de -SUMOylated by SENP1.The SUMOylation of Kif18A was decreased in HeLa cells arrested in G2 /M phase.Conclusion Kif18A can be SUMOylated and its SUMOylation is regulated by mitosis progression.
