中华妇产科杂志
中華婦產科雜誌
중화부산과잡지
Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology
2015年
9期
685-691
,共7页
王静璐%史惠蓉%谢娅%彭铮
王靜璐%史惠蓉%謝婭%彭錚
왕정로%사혜용%사아%팽쟁
子宫内膜肿瘤%二甲双胍%细胞增殖%受体,表皮生长因子%喹唑啉类%酪氨酸磷酸化抑制剂
子宮內膜腫瘤%二甲雙胍%細胞增殖%受體,錶皮生長因子%喹唑啉類%酪氨痠燐痠化抑製劑
자궁내막종류%이갑쌍고%세포증식%수체,표피생장인자%규서람류%락안산린산화억제제
Endometrial neoplasms%Metformin%Cell proliferation%Receptor,epidermal growth factor%Quinazolines%Tyrphostins
目的：探讨二甲双胍对不同分化程度的子宫内膜癌细胞增殖的影响及相关作用机制。方法选取高分化子宫内膜癌细胞系Ishikawa和低分化子宫内膜癌细胞系AN3CA细胞。（1）活细胞计数（CCK-8）法检测二甲双胍和表皮生长因子受体（EGFR）信号通路抑制剂——AG1478作用后Ishikawa和AN3CA细胞增殖能力的变化，实验分为3组，二甲双胍组：加入不同浓度（分别为0.01、0.1、1、5、10 mmol/L，为终浓度，下同）的二甲双胍100μl；AG1478组：加入不同浓度（分别为1、5、10、15μmol/L）的AG1478100μl；二甲双胍+AG1478组：加入不同浓度（分别为0.1、1、5 mmol/L）的二甲双胍和不同浓度（分别为1、5、10μmol/L）的AG1478100μl。各组细胞继续培养24、48、72 h后检测其增殖能力的变化。（2）逆转录（RT）-PCR技术检测不同浓度（分别为0.01、0.1、1、5、10 mmol/L）二甲双胍作用24 h后Ishikawa和AN3CA细胞中EGFR mRNA表达水平的变化。（3）蛋白印迹（western blot）法检测二甲双胍（1 mmol/L）作用不同时间（分别为2、4、6、8 h）后Ishikawa和AN3CA细胞中总EGFR、磷酸化EGFR（p-EGFR）和总细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达水平的变化。结果（1）CCK-8法检测显示，不同浓度的药物作用不同时间后，二甲双胍组、AG1478组、二甲双胍+AG1478组对Ishikawa和AN3CA细胞增殖的抑制作用均呈明显的时间-剂量依赖性（P<0.05）；但二甲双胍对Ishikawa细胞增殖的抑制率明显低于AN3CA细胞（P<0.05），而AG1478、二甲双胍+AG1478对Ishikawa细胞增殖的抑制率明显高于AN3CA细胞（P<0.05），且二甲双胍与AG1478联合应用的抑制率明显高于单一药物（P<0.05）。（2）RT-PCR技术检测显示，不同浓度（分别为0.01、0.1、1、5、10 mmol/L）的二甲双胍作用24 h后，Ishikawa细胞中EGFR mRNA的表达水平分别为0.74±0.03、0.61±0.04、0.46±0.03、0.31±0.03、0.23±0.03，AN3CA细胞中EGFR mRNA的表达水平分别为0.79±0.20、0.61±0.03、0.50±0.05、0.32±0.03、0.26±0.04，其抑制作用均呈明显的浓度依赖性（P<0.01）。（3）western blot法检测显示，与未经二甲双胍作用的细胞比较，二甲双胍分别作用2、4、6、8 h后，Ishikawa及AN3CA细胞中总EGFR和总ERK1/2蛋白的表达水平变化不明显，分别比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；而p-EGFR及p-ERK1/2蛋白的表达水平均明显降低，分别比较，差异均有统计学意义（P<0.01），且呈明显的时间依赖性（P<0.01）。结论二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞的增殖，其抑制作用与癌细胞的分化程度相关；二甲双胍增强AG1478对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用。二甲双胍的作用机制可能通过抑制p-EGFR蛋白从而抑制p-ERK1/2蛋白的表达，进而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。
目的：探討二甲雙胍對不同分化程度的子宮內膜癌細胞增殖的影響及相關作用機製。方法選取高分化子宮內膜癌細胞繫Ishikawa和低分化子宮內膜癌細胞繫AN3CA細胞。（1）活細胞計數（CCK-8）法檢測二甲雙胍和錶皮生長因子受體（EGFR）信號通路抑製劑——AG1478作用後Ishikawa和AN3CA細胞增殖能力的變化，實驗分為3組，二甲雙胍組：加入不同濃度（分彆為0.01、0.1、1、5、10 mmol/L，為終濃度，下同）的二甲雙胍100μl；AG1478組：加入不同濃度（分彆為1、5、10、15μmol/L）的AG1478100μl；二甲雙胍+AG1478組：加入不同濃度（分彆為0.1、1、5 mmol/L）的二甲雙胍和不同濃度（分彆為1、5、10μmol/L）的AG1478100μl。各組細胞繼續培養24、48、72 h後檢測其增殖能力的變化。（2）逆轉錄（RT）-PCR技術檢測不同濃度（分彆為0.01、0.1、1、5、10 mmol/L）二甲雙胍作用24 h後Ishikawa和AN3CA細胞中EGFR mRNA錶達水平的變化。（3）蛋白印跡（western blot）法檢測二甲雙胍（1 mmol/L）作用不同時間（分彆為2、4、6、8 h）後Ishikawa和AN3CA細胞中總EGFR、燐痠化EGFR（p-EGFR）和總細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）、燐痠化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白錶達水平的變化。結果（1）CCK-8法檢測顯示，不同濃度的藥物作用不同時間後，二甲雙胍組、AG1478組、二甲雙胍+AG1478組對Ishikawa和AN3CA細胞增殖的抑製作用均呈明顯的時間-劑量依賴性（P<0.05）；但二甲雙胍對Ishikawa細胞增殖的抑製率明顯低于AN3CA細胞（P<0.05），而AG1478、二甲雙胍+AG1478對Ishikawa細胞增殖的抑製率明顯高于AN3CA細胞（P<0.05），且二甲雙胍與AG1478聯閤應用的抑製率明顯高于單一藥物（P<0.05）。（2）RT-PCR技術檢測顯示，不同濃度（分彆為0.01、0.1、1、5、10 mmol/L）的二甲雙胍作用24 h後，Ishikawa細胞中EGFR mRNA的錶達水平分彆為0.74±0.03、0.61±0.04、0.46±0.03、0.31±0.03、0.23±0.03，AN3CA細胞中EGFR mRNA的錶達水平分彆為0.79±0.20、0.61±0.03、0.50±0.05、0.32±0.03、0.26±0.04，其抑製作用均呈明顯的濃度依賴性（P<0.01）。（3）western blot法檢測顯示，與未經二甲雙胍作用的細胞比較，二甲雙胍分彆作用2、4、6、8 h後，Ishikawa及AN3CA細胞中總EGFR和總ERK1/2蛋白的錶達水平變化不明顯，分彆比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；而p-EGFR及p-ERK1/2蛋白的錶達水平均明顯降低，分彆比較，差異均有統計學意義（P<0.01），且呈明顯的時間依賴性（P<0.01）。結論二甲雙胍抑製子宮內膜癌細胞的增殖，其抑製作用與癌細胞的分化程度相關；二甲雙胍增彊AG1478對子宮內膜癌細胞增殖的抑製作用。二甲雙胍的作用機製可能通過抑製p-EGFR蛋白從而抑製p-ERK1/2蛋白的錶達，進而抑製子宮內膜癌細胞的增殖。
목적：탐토이갑쌍고대불동분화정도적자궁내막암세포증식적영향급상관작용궤제。방법선취고분화자궁내막암세포계Ishikawa화저분화자궁내막암세포계AN3CA세포。（1）활세포계수（CCK-8）법검측이갑쌍고화표피생장인자수체（EGFR）신호통로억제제——AG1478작용후Ishikawa화AN3CA세포증식능력적변화，실험분위3조，이갑쌍고조：가입불동농도（분별위0.01、0.1、1、5、10 mmol/L，위종농도，하동）적이갑쌍고100μl；AG1478조：가입불동농도（분별위1、5、10、15μmol/L）적AG1478100μl；이갑쌍고+AG1478조：가입불동농도（분별위0.1、1、5 mmol/L）적이갑쌍고화불동농도（분별위1、5、10μmol/L）적AG1478100μl。각조세포계속배양24、48、72 h후검측기증식능력적변화。（2）역전록（RT）-PCR기술검측불동농도（분별위0.01、0.1、1、5、10 mmol/L）이갑쌍고작용24 h후Ishikawa화AN3CA세포중EGFR mRNA표체수평적변화。（3）단백인적（western blot）법검측이갑쌍고（1 mmol/L）작용불동시간（분별위2、4、6、8 h）후Ishikawa화AN3CA세포중총EGFR、린산화EGFR（p-EGFR）화총세포외신호조절격매1/2（ERK1/2）、린산화ERK1/2（p-ERK1/2）단백표체수평적변화。결과（1）CCK-8법검측현시，불동농도적약물작용불동시간후，이갑쌍고조、AG1478조、이갑쌍고+AG1478조대Ishikawa화AN3CA세포증식적억제작용균정명현적시간-제량의뢰성（P<0.05）；단이갑쌍고대Ishikawa세포증식적억제솔명현저우AN3CA세포（P<0.05），이AG1478、이갑쌍고+AG1478대Ishikawa세포증식적억제솔명현고우AN3CA세포（P<0.05），차이갑쌍고여AG1478연합응용적억제솔명현고우단일약물（P<0.05）。（2）RT-PCR기술검측현시，불동농도（분별위0.01、0.1、1、5、10 mmol/L）적이갑쌍고작용24 h후，Ishikawa세포중EGFR mRNA적표체수평분별위0.74±0.03、0.61±0.04、0.46±0.03、0.31±0.03、0.23±0.03，AN3CA세포중EGFR mRNA적표체수평분별위0.79±0.20、0.61±0.03、0.50±0.05、0.32±0.03、0.26±0.04，기억제작용균정명현적농도의뢰성（P<0.01）。（3）western blot법검측현시，여미경이갑쌍고작용적세포비교，이갑쌍고분별작용2、4、6、8 h후，Ishikawa급AN3CA세포중총EGFR화총ERK1/2단백적표체수평변화불명현，분별비교，차이균무통계학의의（P>0.05）；이p-EGFR급p-ERK1/2단백적표체수평균명현강저，분별비교，차이균유통계학의의（P<0.01），차정명현적시간의뢰성（P<0.01）。결론이갑쌍고억제자궁내막암세포적증식，기억제작용여암세포적분화정도상관；이갑쌍고증강AG1478대자궁내막암세포증식적억제작용。이갑쌍고적작용궤제가능통과억제p-EGFR단백종이억제p-ERK1/2단백적표체，진이억제자궁내막암세포적증식。
Objective To investigate the effects of metformin on cell proliferation in differentiation degree of endometrial carcinoma cells and related mechanisms. Methods The endometrial cancer cell lines Ishikawa and AN3CA were used. Cell proliferation was assessed after exposure to metformin with or without epithelial growth factor receptor (EGFR) inhibitor AG1478 by cell counting kit-8 (CCK-8) method. EGFR mRNA was determined by reverse transcription (RT)-PCR. The expression of phosphorylation EGFR (p-EGFR) and total EGFR (t-EGFR) and phosphorylation extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) and total ERK1/2 (t-ERK1/2) were examined by western blot. Results (1)CCK-8 experiment showed that metformin could inhibit the proliferation of endometrial cancer cells in a time-dependent manner and a dose-dependent manner (P<0.05), but the inhibition of well differentiated cell line Ishikawa was lower than that in poorly differentiated cells AN3CA (P<0.05). AG1478 also could inhibit the proliferation of endometrial cancer cells in a time-dependent manner and in a dose-dependent manner (P<0.05), but the inhibition rate of well differentiated cell line Ishikawa was higher than that in poorly differentiated cells AN3CA (P<0.05). Metformin+AG1478 also could inhibit the proliferation of endometrial cancer cells in a time-dependent manner and in a dose-dependent manner (P<0.05), and the inhibition of combined with metformin and AG1478 was stronger than that with a single application of drugs, but the inhibition rate of Ishikawa was higher than that in AN3CA (P<0.05).(2)RT-PCR method showed that different concentrations of metformin (0.01, 0.1, 1, 5, 10 mmol/L, respectively) for 24 hours, the expression level of EGFR mRNA in Ishikawa cells were respectively 0.74±0.03, 0.61±0.04, 0.46±0.03, 0.31±0.03 and 0.23±0.03, the expression level of EGFR mRNA in AN3CA cells were respectively 0.79±0.20, 0.61±0.03, 0.50±0.05, 0.32±0.03 and 0.26 ± 0.04, the inhibition effect showed a significant concentration-dependent manner (all P<0.01). (3) Western blot method displayed that the effect of metformin treated respectively 2, 4, 6 or 8 hours, there were not significant difference in the expression levels of t-EGFR protein and t-ERK1/2 between Ishikawa and AN3CA cells (all P>0.05). But the expression levels of p-EGFR and p-ERK1/2 protein were significantly lower between two groups (P<0.01), which showed a time-dependent manner(P<0.01). Conclusion Metformin could inhibit the proliferation of endometrial cancer cells, the inhibition is associated with the differentiation degree of cancer cells. Metformin could enhance the EGFR signaling pathway inhibitor AG1478 inhibition of endometrial cancer cells, which may inhibit EGFR expression of phosphorylated proteins to inhibit the phosphorylation of ERK1/2 proteins and then inhibit proliferation of endometrial cancer cells.
