海洋学报（中文版）
海洋學報（中文版）
해양학보（중문판）
Acta Oceanologica Sinica
2015年
11期
165-177
,共13页
孙茜%廖丽%丁海涛%刘双%陈波
孫茜%廖麗%丁海濤%劉雙%陳波
손천%료려%정해도%류쌍%진파
北冰洋%海单胞菌%β-D-半乳糖苷酶%异源表达%酶学特性
北冰洋%海單胞菌%β-D-半乳糖苷酶%異源錶達%酶學特性
북빙양%해단포균%β-D-반유당감매%이원표체%매학특성
the Arctic Ocean%β-galactosidase%Marinomonas%heterologous expression%enzymatic properties
初筛表明，一株分离自北极加拿大海盆海冰心芯样品的海单胞菌（Marinomonas sp．BSi20584）具有较高的β-D-半乳糖苷酶活性，为了研究清楚其酶学性质，将经 hiTAIL-PCR 扩增得到的β-D-半乳糖苷酶基因（galt）与 pET-28a（＋）原核表达载体结合，转入大肠杆菌 BL21（DE3）。经 IPTG 诱导后对重组β-D-半乳糖苷酶（GALT）的表达条件进行了优化，采用金属螯合亲和层析技术制备纯酶，并对重组 GALT 的酶学性质进行了研究。结果显示，重组酶的最适诱导温度为20℃，在 IPTG 浓度为0．07 mmol／L 时诱导22 h 后，酶活和产酶量达到最大值。GALT 单体分子量约为6．6×104 g／mol，天然酶为同源三聚体。GALT 最适作用温度为35℃，其热稳定性较好，在60℃处理5 h 后，仍可保持50％以上的相对活性。GALT 的最适作用 pH 为9．0，在 pH 为6．0～11．0范围内比较稳定。GALT 的最适NaCl 浓度为0．5 mol／L，对盐度具有较高的耐受性。Mg2＋、K＋、DTT 和 EDTA 对酶活不具有显著影响，而 Mn2＋、Fe2＋对酶活有促进作用，Zn2＋和 L-谷胱甘肽对酶活有抑制作用。GALT 对 Galβ1-4 Glc-NAc 具有水解作用，而对 Galβ1-3 GalNAc 和 Galβ1-3 GlcNAc 糖苷键型没有水解能力。本研究实现了海单胞菌属菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌系统中的高效表达，并系统研究了重组酶的酶学特性，为后续开展该酶的代谢适应性和潜在应用研究提供详细的酶学数据基础。
初篩錶明，一株分離自北極加拿大海盆海冰心芯樣品的海單胞菌（Marinomonas sp．BSi20584）具有較高的β-D-半乳糖苷酶活性，為瞭研究清楚其酶學性質，將經 hiTAIL-PCR 擴增得到的β-D-半乳糖苷酶基因（galt）與 pET-28a（＋）原覈錶達載體結閤，轉入大腸桿菌 BL21（DE3）。經 IPTG 誘導後對重組β-D-半乳糖苷酶（GALT）的錶達條件進行瞭優化，採用金屬螯閤親和層析技術製備純酶，併對重組 GALT 的酶學性質進行瞭研究。結果顯示，重組酶的最適誘導溫度為20℃，在 IPTG 濃度為0．07 mmol／L 時誘導22 h 後，酶活和產酶量達到最大值。GALT 單體分子量約為6．6×104 g／mol，天然酶為同源三聚體。GALT 最適作用溫度為35℃，其熱穩定性較好，在60℃處理5 h 後，仍可保持50％以上的相對活性。GALT 的最適作用 pH 為9．0，在 pH 為6．0～11．0範圍內比較穩定。GALT 的最適NaCl 濃度為0．5 mol／L，對鹽度具有較高的耐受性。Mg2＋、K＋、DTT 和 EDTA 對酶活不具有顯著影響，而 Mn2＋、Fe2＋對酶活有促進作用，Zn2＋和 L-穀胱甘肽對酶活有抑製作用。GALT 對 Galβ1-4 Glc-NAc 具有水解作用，而對 Galβ1-3 GalNAc 和 Galβ1-3 GlcNAc 糖苷鍵型沒有水解能力。本研究實現瞭海單胞菌屬菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌繫統中的高效錶達，併繫統研究瞭重組酶的酶學特性，為後續開展該酶的代謝適應性和潛在應用研究提供詳細的酶學數據基礎。
초사표명，일주분리자북겁가나대해분해빙심심양품적해단포균（Marinomonas sp．BSi20584）구유교고적β-D-반유당감매활성，위료연구청초기매학성질，장경 hiTAIL-PCR 확증득도적β-D-반유당감매기인（galt）여 pET-28a（＋）원핵표체재체결합，전입대장간균 BL21（DE3）。경 IPTG 유도후대중조β-D-반유당감매（GALT）적표체조건진행료우화，채용금속오합친화층석기술제비순매，병대중조 GALT 적매학성질진행료연구。결과현시，중조매적최괄유도온도위20℃，재 IPTG 농도위0．07 mmol／L 시유도22 h 후，매활화산매량체도최대치。GALT 단체분자량약위6．6×104 g／mol，천연매위동원삼취체。GALT 최괄작용온도위35℃，기열은정성교호，재60℃처리5 h 후，잉가보지50％이상적상대활성。GALT 적최괄작용 pH 위9．0，재 pH 위6．0～11．0범위내비교은정。GALT 적최괄NaCl 농도위0．5 mol／L，대염도구유교고적내수성。Mg2＋、K＋、DTT 화 EDTA 대매활불구유현저영향，이 Mn2＋、Fe2＋대매활유촉진작용，Zn2＋화 L-곡광감태대매활유억제작용。GALT 대 Galβ1-4 Glc-NAc 구유수해작용，이대 Galβ1-3 GalNAc 화 Galβ1-3 GlcNAc 당감건형몰유수해능력。본연구실현료해단포균속균주적β-D-반유당감매기인재대장간균계통중적고효표체，병계통연구료중조매적매학특성，위후속개전해매적대사괄응성화잠재응용연구제공상세적매학수거기출。
A Marinomonas strain isolated from an ice core sample collected from Canada Basin,Arctic Ocean,dis-played highβ-galactosidase activity in the preliminary screening process.To get its overall understanding towards its enzymatic properties,the galt gene obtained by hiTAIL-PCR amplification was inserted into plasmid pET-28a (+),then transformed into E.coli BL21 (DE3).The recombinant enzyme was purified to electrophoretic homoge-neity by one step Ni2+ affinity chromatography.The highest yield was achieved with 0.07mM IPTG when cultivat-ed in 20℃ for 22 h.The molecular weight of the monomeric GALT was estimated as about 6.6×104 g/mol and the native GALT was confirmed as homologous trimer through native-PAGE.The optimum temperature of GALT was 35℃ and showed good thermal stability at the temperature of 60℃ below.The optimum pH of GALT was 9.0 and was stable between pH 6.0 and 11.0.GALT showed high tolerance to salinity and the optimum NaCl concentration was 0.5 mol/L.Mineral ions Fe2+ and Mn2+ were identified as enzyme activators,Mg2+ ,K+ ,DTT and EDTA showed no significant influence towards the enzyme activity,while Zn2+ and L-glutathione inhibited the activity strongly.GALT was able to hydrolyse Galβ1-4 GlcNAc but unable to hydrolyze Galβ1-3 GalNAc and Galβ1-3 GlcNAc.In this study,theβ-galactosidase gene from Marinomonas sp.BSi20584 was successfully expressed in E.coli system,and a systematic understanding of the enzymatic properties of the recombinant GALT was ac-quired,which will provide the detailed enzymatic data for further studies on its metabolic adaptation and potential applications.
