四川大学学报（自然科学版）
四川大學學報（自然科學版）
사천대학학보（자연과학판）
Journal of Sichuan University(Natural Science Edition)
2015年
5期
1151-1156
,共6页
刘健%赵霏霏%陈应娟%吴阳晨%朱桐%席德慧%林宏辉
劉健%趙霏霏%陳應娟%吳暘晨%硃桐%席德慧%林宏輝
류건%조비비%진응연%오양신%주동%석덕혜%림굉휘
辣椒脉斑驳病毒%侵染性克隆%体外转录%重叠PCR
辣椒脈斑駁病毒%侵染性剋隆%體外轉錄%重疊PCR
랄초맥반박병독%침염성극륭%체외전록%중첩PCR
Chilli veinal mottle virus%Infectious clone%In vitro transcription%Overlapping PCR
本文介绍了一种构建辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)侵染性克隆的简易方法.基于辣椒脉斑驳病毒的全长确定序列,根据基因内部的单一限制性酶切位点,设计引物,将ChiVMV分成KL1,KL2,KL3三个片段通过RT-PCR和TA克隆的方法将3个片段构建到PMD19-T载体上.通过双酶切将ChiVMV前面7000bp的片段构建到载体上,从而将全部的ChiVMV cDNA分段构建到两个重组质粒中,成功地避免了全长病毒序列在大肠杆菌中不稳定的现象.进行体外转录时,先通过PCR扩增出两个彼此有一定重叠的平末端片段,再利用两个重叠片段为模板用重叠PCR的方法扩增出全长带T7启动子的ChiVMV cDNA,并通过T7 RNA聚合酶成功转录出ChiVMV的病毒RNA.
本文介紹瞭一種構建辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)侵染性剋隆的簡易方法.基于辣椒脈斑駁病毒的全長確定序列,根據基因內部的單一限製性酶切位點,設計引物,將ChiVMV分成KL1,KL2,KL3三箇片段通過RT-PCR和TA剋隆的方法將3箇片段構建到PMD19-T載體上.通過雙酶切將ChiVMV前麵7000bp的片段構建到載體上,從而將全部的ChiVMV cDNA分段構建到兩箇重組質粒中,成功地避免瞭全長病毒序列在大腸桿菌中不穩定的現象.進行體外轉錄時,先通過PCR擴增齣兩箇彼此有一定重疊的平末耑片段,再利用兩箇重疊片段為模闆用重疊PCR的方法擴增齣全長帶T7啟動子的ChiVMV cDNA,併通過T7 RNA聚閤酶成功轉錄齣ChiVMV的病毒RNA.
본문개소료일충구건랄초맥반박병독(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)침염성극륭적간역방법.기우랄초맥반박병독적전장학정서렬,근거기인내부적단일한제성매절위점,설계인물,장ChiVMV분성KL1,KL2,KL3삼개편단통과RT-PCR화TA극륭적방법장3개편단구건도PMD19-T재체상.통과쌍매절장ChiVMV전면7000bp적편단구건도재체상,종이장전부적ChiVMV cDNA분단구건도량개중조질립중,성공지피면료전장병독서렬재대장간균중불은정적현상.진행체외전록시,선통과PCR확증출량개피차유일정중첩적평말단편단,재이용량개중첩편단위모판용중첩PCR적방법확증출전장대T7계동자적ChiVMV cDNA,병통과T7 RNA취합매성공전록출ChiVMV적병독RNA.
