中国脊柱脊髓杂志
中國脊柱脊髓雜誌
중국척주척수잡지
Chinese Journal of Spine and Spinal Cord
2015年
10期
912-919
,共8页
王汉邦%陶晖%申才良%李海太
王漢邦%陶暉%申纔良%李海太
왕한방%도휘%신재량%리해태
椎间盘退变%髓核间充质干细胞%酸环境%生物学活性
椎間盤退變%髓覈間充質榦細胞%痠環境%生物學活性
추간반퇴변%수핵간충질간세포%산배경%생물학활성
Intervertebral disc degeneration%Nucleus mesenchymal stem cell%Acid environment%Biological characteristics
目的:观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学特征的影响,探讨椎间盘退变的可能机制.方法:用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代并观察细胞形态.取P2代细胞,利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况进行检测;用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞,2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力.按照国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定.在37℃、21％O2、5％CO2的细胞培养箱中用不同pH值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10％血清培养液培养P2代细胞,1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力(OD值),培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率,不同pH值培养基培养28d时采用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA表达情况.结果:P0代细胞均贴壁生长.P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、95％、94％以上,低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4％).茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化.按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离得到的细胞即NPMSCs.细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义(P＞0.05);5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义(P＜0.05),且pH值越低细胞的OD值越小.pH值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组,各组间有统计学差异(P＜0.05).pH值7.4组"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA均明显高于pH值7.1、6.8、6.5、6.2组(P＜0.05).随着培养液pH值降低,细胞的凋亡率升高,细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的mRNA表达降低.结论:低pH值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响,培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达,促进细胞凋亡,且随着pH降低作用越明显.
目的:觀察痠環境對體外培養的成人髓覈間充質榦細胞(NPMSCs)生物學特徵的影響,探討椎間盤退變的可能機製.方法:用膠原酶消化法從6例脊柱側凸矯形患者手術摘除的6箇腰椎間盤(Pfirrmann椎間盤退變分級為Ⅰ級或Ⅱ級)髓覈組織中分離細胞,體外培養,傳代併觀察細胞形態.取P2代細胞,利用流式細胞儀對分離得到的細胞錶型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人類白細胞抗原(HLA)-DR錶達情況進行檢測;用成骨、成軟骨、成脂培養液誘導培養細胞,2週後分彆用茜素紅、甲苯胺藍、油紅O對細胞進行染色,觀察其成脂、成骨、成軟骨能力.按照國際榦細胞治療協會(ISCT)有關間充質榦細胞(MSCs)的判定標準,對分離得到的細胞進行綜閤評估鑒定.在37℃、21％O2、5％CO2的細胞培養箱中用不同pH值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10％血清培養液培養P2代細胞,1、3、5、7、9、11、13d後利用細胞增殖試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測細胞增殖活力(OD值),培養3d時藉助流式細胞儀檢測細胞凋亡率,不同pH值培養基培養28d時採用實時熒光定量(RT-PCR)檢測P2代細胞"榦性維持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及痠離子通道傢族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA錶達情況.結果:P0代細胞均貼壁生長.P2代細胞免疫錶型鑒定顯示MSCs錶麵分子標記CD90、CD105、CD73錶達比例分彆高達96％、95％、94％以上,低錶達CD45、CD34、HLA-DR(均低于4％).茜素紅染色、油紅O染色及甲苯胺藍染色分彆證實分離的細胞均可嚮骨、脂肪及軟骨細胞三繫誘導分化.按照ISCT有關MSCs的判定標準,分離得到的細胞即NPMSCs.細胞代謝活性測定示P2代細胞在培養後1、3d各組間細胞OD值差異無統計學意義(P＞0.05);5d、7d、9d、11d、13d各組間細胞OD值差異有統計學意義(P＜0.05),且pH值越低細胞的OD值越小.pH值7.4組的細胞凋亡率均小于其餘各組,各組間有統計學差異(P＜0.05).pH值7.4組"榦性維持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及痠離子通道傢族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA均明顯高于pH值7.1、6.8、6.5、6.2組(P＜0.05).隨著培養液pH值降低,細胞的凋亡率升高,細胞榦性維持基因及痠通道傢族蛋白基因的mRNA錶達降低.結論:低pH值的痠環境培養1、3d對成人NPMSCs增殖無明顯影響,培養5d後明顯抑製NPMSCs的增殖和基因錶達,促進細胞凋亡,且隨著pH降低作用越明顯.
목적:관찰산배경대체외배양적성인수핵간충질간세포(NPMSCs)생물학특정적영향,탐토추간반퇴변적가능궤제.방법:용효원매소화법종6례척주측철교형환자수술적제적6개요추간반(Pfirrmann추간반퇴변분급위Ⅰ급혹Ⅱ급)수핵조직중분리세포,체외배양,전대병관찰세포형태.취P2대세포,이용류식세포의대분리득도적세포표형CD34、CD45、CD73、CD90、CD105화인류백세포항원(HLA)-DR표체정황진행검측;용성골、성연골、성지배양액유도배양세포,2주후분별용천소홍、갑분알람、유홍O대세포진행염색,관찰기성지、성골、성연골능력.안조국제간세포치료협회(ISCT)유관간충질간세포(MSCs)적판정표준,대분리득도적세포진행종합평고감정.재37℃、21％O2、5％CO2적세포배양상중용불동pH치(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)적DMEM10％혈청배양액배양P2대세포,1、3、5、7、9、11、13d후이용세포증식시제합(cell counting kit-8,CCK-8)검측세포증식활력(OD치),배양3d시차조류식세포의검측세포조망솔,불동pH치배양기배양28d시채용실시형광정량(RT-PCR)검측P2대세포"간성유지"기인Oct4、Nanog、Jag1、Notch1급산리자통도가족단백기인ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4적mRNA표체정황.결과:P0대세포균첩벽생장.P2대세포면역표형감정현시MSCs표면분자표기CD90、CD105、CD73표체비례분별고체96％、95％、94％이상,저표체CD45、CD34、HLA-DR(균저우4％).천소홍염색、유홍O염색급갑분알람염색분별증실분리적세포균가향골、지방급연골세포삼계유도분화.안조ISCT유관MSCs적판정표준,분리득도적세포즉NPMSCs.세포대사활성측정시P2대세포재배양후1、3d각조간세포OD치차이무통계학의의(P＞0.05);5d、7d、9d、11d、13d각조간세포OD치차이유통계학의의(P＜0.05),차pH치월저세포적OD치월소.pH치7.4조적세포조망솔균소우기여각조,각조간유통계학차이(P＜0.05).pH치7.4조"간성유지"기인Oct4、Nanog、Jag1、Notch1급산리자통도가족단백기인ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4적mRNA균명현고우pH치7.1、6.8、6.5、6.2조(P＜0.05).수착배양액pH치강저,세포적조망솔승고,세포간성유지기인급산통도가족단백기인적mRNA표체강저.결론:저pH치적산배경배양1、3d대성인NPMSCs증식무명현영향,배양5d후명현억제NPMSCs적증식화기인표체,촉진세포조망,차수착pH강저작용월명현.
