CAJ | 학술논문

目的：探讨小鼠心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶p300和p300/CBP辅助因子（PCAF）对心脏发育基因NKX2.5的动态调控作用，为进一步明确心脏发育的调控机制提供新的理论基础。 　　方法：收集胚胎14.5 d、16.5 d及新生0.5 d和7 d的正常C57BL/6小鼠心脏，实验分为4组：胚胎14.5 d组（n=10）、胚胎16.5 d组（n=10）、新生0.5 d组（n=5）、新生7 d组（n=3）。采用染色质免疫共沉淀技术，运用抗p300、PCAF、组蛋白H3K9ac抗体沉淀与其相结合的脱氧核糖核酸（DNA）片段，实时荧光定量聚合酶链反应扩增抗体所富集的DNA片段来检测NKX2.5启动子区域p300和PCAF结合水平及H3K9ac乙酰化水平。此外，运用逆转录聚合酶链反应检测NKX2.5基因信使核糖核酸（mRNA）表达水平。 　　结果：p300和PCAF结合水平在心脏发育的不同阶段均具有时序性：p300的结合水平在胚胎16.5 d组（0.063±0.021）、新生0.5 d组（0.019±0.008）、新生7 d组（0.011±0.003）均低于胚胎14.5 d组（0.231±0.033），且新生0.5 d组和新生7 d组均低于胚胎16.5 d组，差异均有统计学意义（P均<0.05）；PCAF结合水平在胚胎16.5 d组（0.063±0.021）、新生0.5 d组（0.019±0.008）、新生7 d组（0.011±0.003）均低于胚胎14.5 d组（0.185±0.023），差异均有统计学意义（P均<0.05）。H3K9ac乙酰化水平及NKX2.5基因mRNA表达水平在心脏发育的不同阶段均具有时序性：H3K9ac乙酰化水平在胚胎16.5 d组（0.098±0.014）、新生0.5 d组（0.074±0.010）、新生7 d组（0.045±0.014）均低于胚胎14.5 d组（0.119±0.020），且新生7 d组低于胚胎16.5 d组，差异均有统计学意义（P均<0.05）；NKX2.5基因mRNA表达水平在胚胎16.5d组（0.701±0.181）、新生0.5 d组（0.502±0.159）、新生7 d组（0.529±0.131）均低于胚胎14.5 d组（1.000±0.130），差异均有统计学意义（P均<0.05）。 　　结论：组蛋白乙酰化酶p300和PCAF动态调控NKX2.5启动子区域H3K9ac乙酰化水平，且在小鼠心脏发育过程中NKX2.5 mRNA呈现动态表达。目的：探討小鼠心髒髮育過程中組蛋白乙酰化酶p300和p300/CBP輔助因子（PCAF）對心髒髮育基因NKX2.5的動態調控作用，為進一步明確心髒髮育的調控機製提供新的理論基礎。 　　方法：收集胚胎14.5 d、16.5 d及新生0.5 d和7 d的正常C57BL/6小鼠心髒，實驗分為4組：胚胎14.5 d組（n=10）、胚胎16.5 d組（n=10）、新生0.5 d組（n=5）、新生7 d組（n=3）。採用染色質免疫共沉澱技術，運用抗p300、PCAF、組蛋白H3K9ac抗體沉澱與其相結閤的脫氧覈糖覈痠（DNA）片段，實時熒光定量聚閤酶鏈反應擴增抗體所富集的DNA片段來檢測NKX2.5啟動子區域p300和PCAF結閤水平及H3K9ac乙酰化水平。此外，運用逆轉錄聚閤酶鏈反應檢測NKX2.5基因信使覈糖覈痠（mRNA）錶達水平。 　　結果：p300和PCAF結閤水平在心髒髮育的不同階段均具有時序性：p300的結閤水平在胚胎16.5 d組（0.063±0.021）、新生0.5 d組（0.019±0.008）、新生7 d組（0.011±0.003）均低于胚胎14.5 d組（0.231±0.033），且新生0.5 d組和新生7 d組均低于胚胎16.5 d組，差異均有統計學意義（P均<0.05）；PCAF結閤水平在胚胎16.5 d組（0.063±0.021）、新生0.5 d組（0.019±0.008）、新生7 d組（0.011±0.003）均低于胚胎14.5 d組（0.185±0.023），差異均有統計學意義（P均<0.05）。H3K9ac乙酰化水平及NKX2.5基因mRNA錶達水平在心髒髮育的不同階段均具有時序性：H3K9ac乙酰化水平在胚胎16.5 d組（0.098±0.014）、新生0.5 d組（0.074±0.010）、新生7 d組（0.045±0.014）均低于胚胎14.5 d組（0.119±0.020），且新生7 d組低于胚胎16.5 d組，差異均有統計學意義（P均<0.05）；NKX2.5基因mRNA錶達水平在胚胎16.5d組（0.701±0.181）、新生0.5 d組（0.502±0.159）、新生7 d組（0.529±0.131）均低于胚胎14.5 d組（1.000±0.130），差異均有統計學意義（P均<0.05）。 　　結論：組蛋白乙酰化酶p300和PCAF動態調控NKX2.5啟動子區域H3K9ac乙酰化水平，且在小鼠心髒髮育過程中NKX2.5 mRNA呈現動態錶達。
목적：탐토소서심장발육과정중조단백을선화매p300화p300/CBP보조인자（PCAF）대심장발육기인NKX2.5적동태조공작용，위진일보명학심장발육적조공궤제제공신적이론기출。 　　방법：수집배태14.5 d、16.5 d급신생0.5 d화7 d적정상C57BL/6소서심장，실험분위4조：배태14.5 d조（n=10）、배태16.5 d조（n=10）、신생0.5 d조（n=5）、신생7 d조（n=3）。채용염색질면역공침정기술，운용항p300、PCAF、조단백H3K9ac항체침정여기상결합적탈양핵당핵산（DNA）편단，실시형광정량취합매련반응확증항체소부집적DNA편단래검측NKX2.5계동자구역p300화PCAF결합수평급H3K9ac을선화수평。차외，운용역전록취합매련반응검측NKX2.5기인신사핵당핵산（mRNA）표체수평。 　　결과：p300화PCAF결합수평재심장발육적불동계단균구유시서성：p300적결합수평재배태16.5 d조（0.063±0.021）、신생0.5 d조（0.019±0.008）、신생7 d조（0.011±0.003）균저우배태14.5 d조（0.231±0.033），차신생0.5 d조화신생7 d조균저우배태16.5 d조，차이균유통계학의의（P균<0.05）；PCAF결합수평재배태16.5 d조（0.063±0.021）、신생0.5 d조（0.019±0.008）、신생7 d조（0.011±0.003）균저우배태14.5 d조（0.185±0.023），차이균유통계학의의（P균<0.05）。H3K9ac을선화수평급NKX2.5기인mRNA표체수평재심장발육적불동계단균구유시서성：H3K9ac을선화수평재배태16.5 d조（0.098±0.014）、신생0.5 d조（0.074±0.010）、신생7 d조（0.045±0.014）균저우배태14.5 d조（0.119±0.020），차신생7 d조저우배태16.5 d조，차이균유통계학의의（P균<0.05）；NKX2.5기인mRNA표체수평재배태16.5d조（0.701±0.181）、신생0.5 d조（0.502±0.159）、신생7 d조（0.529±0.131）균저우배태14.5 d조（1.000±0.130），차이균유통계학의의（P균<0.05）。 　　결론：조단백을선화매p300화PCAF동태조공NKX2.5계동자구역H3K9ac을선화수평，차재소서심장발육과정중NKX2.5 mRNA정현동태표체。
Objective: To explore the dynamic regulation of histone acetylases p300 and p300/CBP associated factor (PCAF) on cardiac development gene NKX2.5 during cardio-genesis and to provide the new theoretical basis to clarify the regulatory mechanism for cardio-genesis in fetal mice. Methods: Our research included 4 groups of cardiac tissues: Embryo (EB) 14.5 days group,n=10, EB 16.5 days group, n=10 and Neonatal 0.5 day group,n=5, Neonatal 7 days group,n=3. Immunoprecipitation was performed in myocardial tissues using anti-p300, anti-PCAF and anti-H3K9ac antibodies to retrieve p300, PCAF and H3K9ac binding DNA, the speciifc DNA sequences were ampliifed by real-time PCR to detect and the binding levels of p300, PCAF and the acetylation level of H3K9ac in NKX2.5 promoter sequence. In addition, the mRNA expression of NKX2.5 was examined by RT-PCR. Results: The binding levels of p300 and PCAF had the timing consequence at different stage of cardio-genesis. The binding level of p300 in EB 16.5 days group (0.063 ± 0.021), Neonatal 0.5 day group (0.019 ± 0.008), Neonatal 7 days group (0.011 ± 0.003) were all lower than that in EB 14.5 days group (0.231 ± 0.033), and in Neonatal 0.5 day group and Neonatal 7 days group were lower than EB 16.5 days group, allP<0.05. The binding level of PCAF in EB 16.5 days group (0.063 ± 0.021), Neonatal 0.5 day group (0.019 ± 0.008), Neonatal 7 days group (0.011 ± 0.003) were all lower than that in EB 14.5 days group (0.185 ± 0.023), allP<0.05. The H3K9ac acetylation level and NKX2.5 mRNA expression level had the timing consequence at different stage of cardio-genesis. H3K9ac acetylation level in EB 16.5 days group (0.098 ± 0.014), Neonatal 0.5 day group (0.074 ± 0.010), Neonatal 7 days group (0.045 ± 0.014) were all lower than that in EB 14.5 days group (0.119 ± 0.020), and in Neonatal 7 days group was lower than EB 16.5 days group, allP<0.05. The NKX2.5 mRNA expression level in EB 16.5 days group (0.701 ± 0.181), Neonatal 0.5 day group (0.502 ± 0.159), Neonatal 7 days group (0.529 ± 0.13) were all lower than that in EB 14.5 days group (1.000 ± 0.130), allP<0.05. Conclusion: Histone acetylases p300 and PCAF may dynamically regulate H3K9ac acetylation in NKX2.5 promoter sequence, and the mRNA of NKX2.5 was dynamically expressed during cardio-genesis in experimental fetal mice.