基础医学与临床
基礎醫學與臨床
기출의학여림상
Basic & Clinical Medicine
2015年
11期
1460-1465
,共6页
张柱霞%孙明英%杨洁%姜树原%石蕊%闫少春%邵国
張柱霞%孫明英%楊潔%薑樹原%石蕊%閆少春%邵國
장주하%손명영%양길%강수원%석예%염소춘%소국
DNA甲基转移酶3B%异构体%胚肾细胞293A%增殖
DNA甲基轉移酶3B%異構體%胚腎細胞293A%增殖
DNA갑기전이매3B%이구체%배신세포293A%증식
DNA methyltransferase 3B%isoform%human embryonic kindey cell line 293A%proliferation
目的 构建6种人DNA甲基转移酶(DNMT)3B典型的异构体的真核表达载体并对其进行过表达,初步探讨其在人胚肾细胞系293A中的生物学作用.方法 以人HCT116 cDNA为模板,采用高保真PCR获得DNMT3B1和DNMT3 B2的全长,并以DNMT3B2为模板,利用特异的引物扩增出DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5和DNMT3B7,将PCR产物连接到真核表达载体pCMV-2B上,并对上述载体进行BamH Ⅰ、EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,将重组质粒转染293A细胞并利用G418筛选出稳定表达的克隆株,MTT法检测细胞增殖活力.结果 双酶切和测序结果表明克隆了6种人DNMT3B异构体CDS序列,经蛋白印迹检测,DNMT3B异构体在293A细胞中获得稳定表达;稳定过表达DNMT3B3、DNMT3B4和DNMT3B7可以抑制细胞增殖.结论 构建了人DNMT3B异构体真核表达载体及获得了其稳定表达细胞株,DNMT3B异构体蛋白对胚肾细胞系293A的增殖有不同的作用.
目的 構建6種人DNA甲基轉移酶(DNMT)3B典型的異構體的真覈錶達載體併對其進行過錶達,初步探討其在人胚腎細胞繫293A中的生物學作用.方法 以人HCT116 cDNA為模闆,採用高保真PCR穫得DNMT3B1和DNMT3 B2的全長,併以DNMT3B2為模闆,利用特異的引物擴增齣DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5和DNMT3B7,將PCR產物連接到真覈錶達載體pCMV-2B上,併對上述載體進行BamH Ⅰ、EcoRⅠ雙酶切和測序鑒定,鑒定正確後,將重組質粒轉染293A細胞併利用G418篩選齣穩定錶達的剋隆株,MTT法檢測細胞增殖活力.結果 雙酶切和測序結果錶明剋隆瞭6種人DNMT3B異構體CDS序列,經蛋白印跡檢測,DNMT3B異構體在293A細胞中穫得穩定錶達;穩定過錶達DNMT3B3、DNMT3B4和DNMT3B7可以抑製細胞增殖.結論 構建瞭人DNMT3B異構體真覈錶達載體及穫得瞭其穩定錶達細胞株,DNMT3B異構體蛋白對胚腎細胞繫293A的增殖有不同的作用.
목적 구건6충인DNA갑기전이매(DNMT)3B전형적이구체적진핵표체재체병대기진행과표체,초보탐토기재인배신세포계293A중적생물학작용.방법 이인HCT116 cDNA위모판,채용고보진PCR획득DNMT3B1화DNMT3 B2적전장,병이DNMT3B2위모판,이용특이적인물확증출DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5화DNMT3B7,장PCR산물련접도진핵표체재체pCMV-2B상,병대상술재체진행BamH Ⅰ、EcoRⅠ쌍매절화측서감정,감정정학후,장중조질립전염293A세포병이용G418사선출은정표체적극륭주,MTT법검측세포증식활력.결과 쌍매절화측서결과표명극륭료6충인DNMT3B이구체CDS서렬,경단백인적검측,DNMT3B이구체재293A세포중획득은정표체;은정과표체DNMT3B3、DNMT3B4화DNMT3B7가이억제세포증식.결론 구건료인DNMT3B이구체진핵표체재체급획득료기은정표체세포주,DNMT3B이구체단백대배신세포계293A적증식유불동적작용.
