基础医学与临床
基礎醫學與臨床
기출의학여림상
Basic & Clinical Medicine
2015年
3期
329-335
,共7页
苟冶然%龙小滨%白磊%何泉%陈检%张绍城%汪德强%周建中
茍冶然%龍小濱%白磊%何泉%陳檢%張紹城%汪德彊%週建中
구야연%룡소빈%백뢰%하천%진검%장소성%왕덕강%주건중
重组葡激酶%人α微球蛋白%RGD%融合蛋白%溶栓活性%抗血小板聚集
重組葡激酶%人α微毬蛋白%RGD%融閤蛋白%溶栓活性%抗血小闆聚集
중조포격매%인α미구단백%RGD%융합단백%용전활성%항혈소판취집
recombinant staphylokinase%human α-microglobulin%RGD%fusion protein%expression and purification%antiplatelet aggregation
目的 构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性.方法 利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-rSAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中.经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白.最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用.结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白.2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白.3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异.4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高.结论 经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础.
目的 構建RGD-重組葡激酶-人α微毬蛋白融閤蛋白的原覈錶達質粒,在大腸桿菌中錶達融閤蛋白,純化併初步鑒定其生物學活性.方法 利用重疊延伸PCR穫得目的融閤基因片段RGD-rSAK-α1M,插入帶有His-GST標籤的原覈高效可溶性錶達載體PEGX-6P-1中.經酶切鑒定後,將重組錶達質粒轉化大腸桿菌BL21菌株,IPTG誘導目的蛋白錶達,經Ni+親和層析柱純化後用3C蛋白酶切除重組蛋白的His-GST標籤,再利用DEAE離子交換柱和分子篩純化蛋白.最後應用纖維蛋白平闆溶圈法和血小闆聚集抑製試驗分彆測定評價重組融閤蛋白的溶栓活性和抗血小闆聚集作用.結果 1)成功構建瞭RGD-重組葡激酶-人α微毬蛋白融閤蛋白.2)實現瞭目的融閤蛋白在大腸桿菌上清液中的高效錶達,併純化瞭融閤蛋白.3)體外實驗錶明純化後的融閤蛋白纖溶活性同尿激酶標準品無明顯差異.4)融閤蛋白抗血小闆聚集作用較單純重組葡激酶明顯提高.結論 經文獻檢索確認為首次穫得瞭純化的RGD-重組葡激酶-人α微毬蛋白融閤蛋白,併驗證瞭其纖溶活性和尿激酶標準品無明顯差異,而抗血小闆聚集作用較單純重組葡激酶增彊,為下一步進行融閤蛋白免疫原性鑒定奠定瞭基礎.
목적 구건RGD-중조포격매-인α미구단백융합단백적원핵표체질립,재대장간균중표체융합단백,순화병초보감정기생물학활성.방법 이용중첩연신PCR획득목적융합기인편단RGD-rSAK-α1M,삽입대유His-GST표첨적원핵고효가용성표체재체PEGX-6P-1중.경매절감정후,장중조표체질립전화대장간균BL21균주,IPTG유도목적단백표체,경Ni+친화층석주순화후용3C단백매절제중조단백적His-GST표첨,재이용DEAE리자교환주화분자사순화단백.최후응용섬유단백평판용권법화혈소판취집억제시험분별측정평개중조융합단백적용전활성화항혈소판취집작용.결과 1)성공구건료RGD-중조포격매-인α미구단백융합단백.2)실현료목적융합단백재대장간균상청액중적고효표체,병순화료융합단백.3)체외실험표명순화후적융합단백섬용활성동뇨격매표준품무명현차이.4)융합단백항혈소판취집작용교단순중조포격매명현제고.결론 경문헌검색학인위수차획득료순화적RGD-중조포격매-인α미구단백융합단백,병험증료기섬용활성화뇨격매표준품무명현차이,이항혈소판취집작용교단순중조포격매증강,위하일보진행융합단백면역원성감정전정료기출.
