中国人兽共患病学报
中國人獸共患病學報
중국인수공환병학보
Chinese Journal of Zoonoses
2015年
11期
1027-1032
,共6页
刘云彦%宋秀平%刘起勇%陈忠科%栗冬梅
劉雲彥%宋秀平%劉起勇%陳忠科%慄鼕梅
류운언%송수평%류기용%진충과%률동매
高分辨率熔解曲线%巴尔通体%猫抓病%战壕热
高分辨率鎔解麯線%巴爾通體%貓抓病%戰壕熱
고분변솔용해곡선%파이통체%묘조병%전호열
High Resolution Melting analysis%Bartonella%cat scratch disease(CSD)%trench fever
目的 应用实时高分辨率熔解曲线PCR技术建立特异性强、灵敏度高和稳定性好快速检测巴尔通体物种方法.方法 查找巴尔通体属特有基因ssrA特异引物进行常规PCR扩增,随后将扩增产物连接到pEASY(R)-T5 Zero克隆载体上制备标准品.优化扩增反应的退火温度和引物浓度,评估实时高分辨率熔解曲线方法的特异性、敏感性及重复性,并与常规PCR进行比较.结果 优化的退火温度为60℃,引物浓度均为300 nmol/L.特异性实验结果显示只有巴尔通体物种扩增出荧光信号,且相对应的熔解温度值为81.05℃±0.31,阴性对照菌株均未见荧光信号和熔解曲线;敏感性实验结果显示在20 μL的反应体系中,实时高分辨率熔解曲线方法检测汉赛巴尔通体物种最低检出限为3.82×101个拷贝,比常规PCR敏感性提高了100倍,此外也显示出良好的线性关系和扩增效率,相关系数R2分别为0.999,E值分别为98.4％.重复性实验结果显示组内和组间的变异系数值为0.30％～0.62％和0.29％～0.36％,在允许范围内.结论 建立的实时高分辨率熔解曲线PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速地检测鉴定巴尔通体物种,为巴尔通体所引起的猫抓病、战壕热、心内膜炎、杆菌性血管瘤和卡瑞恩病等一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段.
目的 應用實時高分辨率鎔解麯線PCR技術建立特異性彊、靈敏度高和穩定性好快速檢測巴爾通體物種方法.方法 查找巴爾通體屬特有基因ssrA特異引物進行常規PCR擴增,隨後將擴增產物連接到pEASY(R)-T5 Zero剋隆載體上製備標準品.優化擴增反應的退火溫度和引物濃度,評估實時高分辨率鎔解麯線方法的特異性、敏感性及重複性,併與常規PCR進行比較.結果 優化的退火溫度為60℃,引物濃度均為300 nmol/L.特異性實驗結果顯示隻有巴爾通體物種擴增齣熒光信號,且相對應的鎔解溫度值為81.05℃±0.31,陰性對照菌株均未見熒光信號和鎔解麯線;敏感性實驗結果顯示在20 μL的反應體繫中,實時高分辨率鎔解麯線方法檢測漢賽巴爾通體物種最低檢齣限為3.82×101箇拷貝,比常規PCR敏感性提高瞭100倍,此外也顯示齣良好的線性關繫和擴增效率,相關繫數R2分彆為0.999,E值分彆為98.4％.重複性實驗結果顯示組內和組間的變異繫數值為0.30％～0.62％和0.29％～0.36％,在允許範圍內.結論 建立的實時高分辨率鎔解麯線PCR方法特異性彊、靈敏度高、穩定性好,可快速地檢測鑒定巴爾通體物種,為巴爾通體所引起的貓抓病、戰壕熱、心內膜炎、桿菌性血管瘤和卡瑞恩病等一繫列疾病的早期快速診斷、鑑測和流行病學調查等研究提供有效手段.
목적 응용실시고분변솔용해곡선PCR기술건립특이성강、령민도고화은정성호쾌속검측파이통체물충방법.방법 사조파이통체속특유기인ssrA특이인물진행상규PCR확증,수후장확증산물련접도pEASY(R)-T5 Zero극륭재체상제비표준품.우화확증반응적퇴화온도화인물농도,평고실시고분변솔용해곡선방법적특이성、민감성급중복성,병여상규PCR진행비교.결과 우화적퇴화온도위60℃,인물농도균위300 nmol/L.특이성실험결과현시지유파이통체물충확증출형광신호,차상대응적용해온도치위81.05℃±0.31,음성대조균주균미견형광신호화용해곡선;민감성실험결과현시재20 μL적반응체계중,실시고분변솔용해곡선방법검측한새파이통체물충최저검출한위3.82×101개고패,비상규PCR민감성제고료100배,차외야현시출량호적선성관계화확증효솔,상관계수R2분별위0.999,E치분별위98.4％.중복성실험결과현시조내화조간적변이계수치위0.30％～0.62％화0.29％～0.36％,재윤허범위내.결론 건립적실시고분변솔용해곡선PCR방법특이성강、령민도고、은정성호,가쾌속지검측감정파이통체물충,위파이통체소인기적묘조병、전호열、심내막염、간균성혈관류화잡서은병등일계렬질병적조기쾌속진단、감측화류행병학조사등연구제공유효수단.
