山东医药
山東醫藥
산동의약
SHANDONG MEDICAL JOURNAL
2012年
35期
35-38
,共4页
核转录因子%真核表达质粒%肾小管上皮细胞
覈轉錄因子%真覈錶達質粒%腎小管上皮細胞
핵전록인자%진핵표체질립%신소관상피세포
目的 为进一步研究核转录因子(PAX2)对肾小管上皮细胞的转分化调控机制提供依据.方法 真核表达质粒( PGC-FU) -PAX2真核表达质粒的构建:设计PAX2的引物,PCR法从单侧输尿管结扎大鼠肾脏中扩增出目的片段,酶切后定向连入PGC-FU载体,将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增；通过PCR及基因测序检测其构建的正确性；PGC-FU-PAX2瞬时转染肾小管上皮细胞模型的建立:脂质体转染法将重组质粒转入肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),RT-PCR法、Western blot法分别检测NRK52E细胞PAX2基因、蛋白表达水平,确认PAX2基因的高表达.结果 RT-PCR法成功克隆大鼠PAX2基因,PCR扩增的片段长度为1 294 bp,含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为408 bp,其基因测序结果显示与预期片段大小一致,目的基因与预期基因序列的同源性为100％,说明PGC-FU-PAX2真核表达质粒构建成功.NRK52E转染的PGC-FU-PAX2质粒能够高表达PAX2,呈现绿色荧光,空载组和对照组NRK52E均未见PAX2高表达.结论 成功构建了真核表达载体PGC-FU-PAX2,建立了PAX2高表达肾小管上皮细胞模型,为PAX2对肾小管上皮细胞的转分化作用机制的研究奠定了实验基础.
目的 為進一步研究覈轉錄因子(PAX2)對腎小管上皮細胞的轉分化調控機製提供依據.方法 真覈錶達質粒( PGC-FU) -PAX2真覈錶達質粒的構建:設計PAX2的引物,PCR法從單側輸尿管結扎大鼠腎髒中擴增齣目的片段,酶切後定嚮連入PGC-FU載體,將該重組質粒轉化到Ecoli感受態細胞中,通過氨芐青黴素抗藥性篩選齣成功轉化的暘性剋隆,併進行擴增；通過PCR及基因測序檢測其構建的正確性；PGC-FU-PAX2瞬時轉染腎小管上皮細胞模型的建立:脂質體轉染法將重組質粒轉入腎小管上皮細胞(NRK52E細胞),RT-PCR法、Western blot法分彆檢測NRK52E細胞PAX2基因、蛋白錶達水平,確認PAX2基因的高錶達.結果 RT-PCR法成功剋隆大鼠PAX2基因,PCR擴增的片段長度為1 294 bp,含有重組質粒的暘性剋隆菌液PCR擴增片段約為408 bp,其基因測序結果顯示與預期片段大小一緻,目的基因與預期基因序列的同源性為100％,說明PGC-FU-PAX2真覈錶達質粒構建成功.NRK52E轉染的PGC-FU-PAX2質粒能夠高錶達PAX2,呈現綠色熒光,空載組和對照組NRK52E均未見PAX2高錶達.結論 成功構建瞭真覈錶達載體PGC-FU-PAX2,建立瞭PAX2高錶達腎小管上皮細胞模型,為PAX2對腎小管上皮細胞的轉分化作用機製的研究奠定瞭實驗基礎.
목적 위진일보연구핵전록인자(PAX2)대신소관상피세포적전분화조공궤제제공의거.방법 진핵표체질립( PGC-FU) -PAX2진핵표체질립적구건:설계PAX2적인물,PCR법종단측수뇨관결찰대서신장중확증출목적편단,매절후정향련입PGC-FU재체,장해중조질립전화도Ecoli감수태세포중,통과안변청매소항약성사선출성공전화적양성극륭,병진행확증；통과PCR급기인측서검측기구건적정학성；PGC-FU-PAX2순시전염신소관상피세포모형적건립:지질체전염법장중조질립전입신소관상피세포(NRK52E세포),RT-PCR법、Western blot법분별검측NRK52E세포PAX2기인、단백표체수평,학인PAX2기인적고표체.결과 RT-PCR법성공극륭대서PAX2기인,PCR확증적편단장도위1 294 bp,함유중조질립적양성극륭균액PCR확증편단약위408 bp,기기인측서결과현시여예기편단대소일치,목적기인여예기기인서렬적동원성위100％,설명PGC-FU-PAX2진핵표체질립구건성공.NRK52E전염적PGC-FU-PAX2질립능구고표체PAX2,정현록색형광,공재조화대조조NRK52E균미견PAX2고표체.결론 성공구건료진핵표체재체PGC-FU-PAX2,건립료PAX2고표체신소관상피세포모형,위PAX2대신소관상피세포적전분화작용궤제적연구전정료실험기출.
