山东医药
山東醫藥
산동의약
SHANDONG MEDICAL JOURNAL
2013年
21期
1-3
,共3页
陈立%钟国强%涂荣会%黎庆捷%何艳
陳立%鐘國彊%塗榮會%黎慶捷%何豔
진립%종국강%도영회%려경첩%하염
心肌缺血%连接蛋白43%RNA干扰%慢病毒感染%大鼠
心肌缺血%連接蛋白43%RNA榦擾%慢病毒感染%大鼠
심기결혈%련접단백43%RNA간우%만병독감염%대서
myocardial ischemia%connexin 43%RNA interference%lentivirus infections%rats
目的 构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用.方法 针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序.用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒.以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度；以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率；应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞.Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果.结果 经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108 TU/mL、转染效率为82.59％.荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10％,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16％.结论 成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达.
目的 構建縫隙連接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒載體,併檢測其對大鼠心肌細胞Cx43基因的作用.方法 針對Cx43基因序列,設計RNA榦擾靶點序列,閤成靶序列的雙鏈DNA,接入pGCL-GFP載體,挑選暘性剋隆行PCR鑒定及測序.用pHelper1.0和pHelper2.0質粒轉染293T細胞,包裝產生具備感染能力的慢病毒.以293T細胞中綠色熒光蛋白的細胞數量計算病毒滴度；以最適感染複數感染大鼠心肌細胞,通過熒光顯微鏡觀察感染效率；應用real-time PCR和Western blot法檢測大鼠心肌細胞.Cx43 mRNA及Cx43蛋白錶達,併評價其抑製效果.結果 經PCR鑒定和測序證實,Cx43慢病毒載體構建正確,其病毒滴度為8×108 TU/mL、轉染效率為82.59％.熒光定量real-time PCR法檢測Cx43 mRNA的抑製率為96.10％,Western blot法檢測Cx43蛋白的抑製率為77.16％.結論 成功構建瞭Cx43基因shRNA慢病毒載體,其能顯著抑製大鼠心肌細胞Cx43基因的錶達.
목적 구건봉극련접단백(Cx)43기인shRNA만병독재체,병검측기대대서심기세포Cx43기인적작용.방법 침대Cx43기인서렬,설계RNA간우파점서렬,합성파서렬적쌍련DNA,접입pGCL-GFP재체,도선양성극륭행PCR감정급측서.용pHelper1.0화pHelper2.0질립전염293T세포,포장산생구비감염능력적만병독.이293T세포중록색형광단백적세포수량계산병독적도；이최괄감염복수감염대서심기세포,통과형광현미경관찰감염효솔；응용real-time PCR화Western blot법검측대서심기세포.Cx43 mRNA급Cx43단백표체,병평개기억제효과.결과 경PCR감정화측서증실,Cx43만병독재체구건정학,기병독적도위8×108 TU/mL、전염효솔위82.59％.형광정량real-time PCR법검측Cx43 mRNA적억제솔위96.10％,Western blot법검측Cx43단백적억제솔위77.16％.결론 성공구건료Cx43기인shRNA만병독재체,기능현저억제대서심기세포Cx43기인적표체.
