分析化学
分析化學
분석화학
Chinese Journal of Analytical Chemistry
2015年
10期
1452-1458
,共7页
刘芳洁%叶明亮%潘彦博%邹汉法
劉芳潔%葉明亮%潘彥博%鄒漢法
류방길%협명량%반언박%추한법
高浓度酶%胶内酶解%磷酸化蛋白质组学
高濃度酶%膠內酶解%燐痠化蛋白質組學
고농도매%효내매해%린산화단백질조학
High concentration trypsin%In-gel digestion%Phosphoproteome analysis
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一项高效的蛋白质分离技术,通过与质谱技术联用,可以鉴定成千上万的蛋白质点.但是,复杂繁琐的操作流程限制了它在蛋白质组学研究方面的广泛应用.本研究表明,高浓度的胰蛋白酶并不会影响胶内酶解后磷酸化肽段的富集,反而可以实现快速高效的蛋白酶解,据此建立了一种快捷、高效的蛋白质酶解方法.首先,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,对50μg复杂蛋白样品进行分离,分成5个组分;然后,选择高浓度胰蛋白酶酶解30 min;最后,运用固定钛离子亲和色谱小柱离心法富集磷酸化肽段.经液相色谱-串联质谱分析,成功鉴定到约2000个磷酸化位点,而传统方法则只鉴定到不足1500个位点.实验表明,在高浓度胰蛋白酶的促进作用下,胶内酶解过程在0.5h内即可以完成,并且得到比对照组更高的磷酸化位点的鉴定量和更低的酶解漏切率,而传统方法需要16 h.这也证实了本方法不仅可以加速酶解反应,同时还能提高蛋白酶解效率.
聚丙烯酰胺凝膠電泳是一項高效的蛋白質分離技術,通過與質譜技術聯用,可以鑒定成韆上萬的蛋白質點.但是,複雜繁瑣的操作流程限製瞭它在蛋白質組學研究方麵的廣汎應用.本研究錶明,高濃度的胰蛋白酶併不會影響膠內酶解後燐痠化肽段的富集,反而可以實現快速高效的蛋白酶解,據此建立瞭一種快捷、高效的蛋白質酶解方法.首先,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳,對50μg複雜蛋白樣品進行分離,分成5箇組分;然後,選擇高濃度胰蛋白酶酶解30 min;最後,運用固定鈦離子親和色譜小柱離心法富集燐痠化肽段.經液相色譜-串聯質譜分析,成功鑒定到約2000箇燐痠化位點,而傳統方法則隻鑒定到不足1500箇位點.實驗錶明,在高濃度胰蛋白酶的促進作用下,膠內酶解過程在0.5h內即可以完成,併且得到比對照組更高的燐痠化位點的鑒定量和更低的酶解漏切率,而傳統方法需要16 h.這也證實瞭本方法不僅可以加速酶解反應,同時還能提高蛋白酶解效率.
취병희선알응효전영시일항고효적단백질분리기술,통과여질보기술련용,가이감정성천상만적단백질점.단시,복잡번쇄적조작류정한제료타재단백질조학연구방면적엄범응용.본연구표명,고농도적이단백매병불회영향효내매해후린산화태단적부집,반이가이실현쾌속고효적단백매해,거차건립료일충쾌첩、고효적단백질매해방법.수선,통과취병희선알응효전영,대50μg복잡단백양품진행분리,분성5개조분;연후,선택고농도이단백매매해30 min;최후,운용고정태리자친화색보소주리심법부집린산화태단.경액상색보-천련질보분석,성공감정도약2000개린산화위점,이전통방법칙지감정도불족1500개위점.실험표명,재고농도이단백매적촉진작용하,효내매해과정재0.5h내즉가이완성,병차득도비대조조경고적린산화위점적감정량화경저적매해루절솔,이전통방법수요16 h.저야증실료본방법불부가이가속매해반응,동시환능제고단백매해효솔.
