北京师范大学学报（自然科学版）
北京師範大學學報（自然科學版）
북경사범대학학보（자연과학판）
JOURNAL OF BEIJING NORMAL UNIVERSITY
2007年
5期
554-557
,共4页
尹吉伟%岳俊杰%李森%井健
尹吉偉%嶽俊傑%李森%井健
윤길위%악준걸%리삼%정건
尿激酶原%KGD序列%边侧序列%纤溶活性%血小板聚集抑制活性
尿激酶原%KGD序列%邊側序列%纖溶活性%血小闆聚集抑製活性
뇨격매원%KGD서렬%변측서렬%섬용활성%혈소판취집억제활성
采用同源转座方法,构建了在尿激酶原K区138～139位点插入了赖氨酸甘氨酸天冬氨酸(KGD)序列的2种尿激酶原嵌合体基因(proUK-KGDW, proUK-KGDS),并以昆虫细胞SF9为宿主获得了高效表达,表达量在33.34 μkat·mL-1, 细胞密度为106·mL-1,表达高峰期表达产物占细胞总蛋白的15%以上.表达产物展示出较高的纤溶活性,并具有良好的人尿激酶原免疫原性,同时,经SDS-PAGE试验检测,昆虫细胞分泌的突变体相对分子质量符合理论预期,为5.4×104,绝大多数为单链态形式.经过离子交换、分子筛层析及超滤浓缩等步骤对突变体蛋白进行了初步纯化,光浊度法试验表明含有KGDW序列的尿激酶原突变体具有较强的血小板聚集抑制活性,而含有KGDS序列的突变体几乎不具有任何活性,表明羧基端边侧序列对KGD展示正常的受体结合活性影响较大.溶解圈试验表明2种突变体均保留了较高的纤溶活性,说明插入序列不影响尿激酶原的酶切活性.
採用同源轉座方法,構建瞭在尿激酶原K區138～139位點插入瞭賴氨痠甘氨痠天鼕氨痠(KGD)序列的2種尿激酶原嵌閤體基因(proUK-KGDW, proUK-KGDS),併以昆蟲細胞SF9為宿主穫得瞭高效錶達,錶達量在33.34 μkat·mL-1, 細胞密度為106·mL-1,錶達高峰期錶達產物佔細胞總蛋白的15%以上.錶達產物展示齣較高的纖溶活性,併具有良好的人尿激酶原免疫原性,同時,經SDS-PAGE試驗檢測,昆蟲細胞分泌的突變體相對分子質量符閤理論預期,為5.4×104,絕大多數為單鏈態形式.經過離子交換、分子篩層析及超濾濃縮等步驟對突變體蛋白進行瞭初步純化,光濁度法試驗錶明含有KGDW序列的尿激酶原突變體具有較彊的血小闆聚集抑製活性,而含有KGDS序列的突變體幾乎不具有任何活性,錶明羧基耑邊側序列對KGD展示正常的受體結閤活性影響較大.溶解圈試驗錶明2種突變體均保留瞭較高的纖溶活性,說明插入序列不影響尿激酶原的酶切活性.
채용동원전좌방법,구건료재뇨격매원K구138～139위점삽입료뢰안산감안산천동안산(KGD)서렬적2충뇨격매원감합체기인(proUK-KGDW, proUK-KGDS),병이곤충세포SF9위숙주획득료고효표체,표체량재33.34 μkat·mL-1, 세포밀도위106·mL-1,표체고봉기표체산물점세포총단백적15%이상.표체산물전시출교고적섬용활성,병구유량호적인뇨격매원면역원성,동시,경SDS-PAGE시험검측,곤충세포분비적돌변체상대분자질량부합이론예기,위5.4×104,절대다수위단련태형식.경과리자교환、분자사층석급초려농축등보취대돌변체단백진행료초보순화,광탁도법시험표명함유KGDW서렬적뇨격매원돌변체구유교강적혈소판취집억제활성,이함유KGDS서렬적돌변체궤호불구유임하활성,표명최기단변측서렬대KGD전시정상적수체결합활성영향교대.용해권시험표명2충돌변체균보류료교고적섬용활성,설명삽입서렬불영향뇨격매원적매절활성.
